Derivazione della sfera di tumore e trattamento da cellule tumorali primarie isolate da Rhabdomyosarcomas del topo
Summary
Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l’isolamento delle cellule primarie del thabdomyosarcoma del topo, la formazione e il trattamento della tumorsfera e il trapianto di allotrapianto a partire dalle colture di cellule di tumori.
Abstract
Il rhabdomyosarcoma (RMS) è il sarcoma dei tessuti molli più comune nei bambini. Sebbene sforzi significativi abbiano permesso l’identificazione di mutazioni comuni associate al RMS e consentito la discriminazione di diversi sottotipi RMS, esistono ancora grandi sfide per lo sviluppo di nuovi trattamenti per migliorare ulteriormente la prognosi. Anche se identificato dall’espressione di marcatori miogenici, c’è ancora una controversia significativa sul fatto che RMS abbia origini miogeniche o non miogene, poiché la cellula di origine è ancora poco compresa. Nel presente studio, viene fornito un metodo affidabile per il saggio di biosfera per rms del topo. Il test si basa sulle proprietà funzionali delle cellule tumorali e consente l’identificazione di popolazioni rare nel tumore con funzioni tumorogene. Sono inoltre descritte le procedure per testare le proteine ricombinanti, integrare i protocolli di trasfezione con il test della biosfera e valutare i geni candidati coinvolti nello sviluppo e nella crescita del tumore. Descritto ulteriormente è una procedura per il trapianto di allotrapianto di sfere tumorali in topi riceventi per convalidare la funzione tumorale in vivo. Nel complesso, il metodo descritto consente l’identificazione e il test affidabili di popolazioni tumorigene RMS rare che possono essere applicate al RMS derivante in contesti diversi. Infine, il protocollo può essere utilizzato come piattaforma per lo screening farmacologico e lo sviluppo futuro delle terapie.
Introduction
Il cancro è una malattia eterogenea; inoltre, lo stesso tipo di tumore può presentare diverse mutazioni genetiche in pazienti diversi, e all’interno di un paziente un tumore è composto da più popolazioni di cellule1. L’eterogeneità rappresenta una sfida nell’identificazione delle cellule responsabili dell’avvio e della propagazione del cancro, ma la loro caratterizzazione è essenziale per lo sviluppo di trattamenti efficienti. La nozione di cellule che propagano il tumore (TPC), una rara popolazione di cellule che contribuiscono allo sviluppo del tumore, è stata precedentemente ampiamente rivista2. Nonostante il fatto che i TPC siano stati caratterizzati in più tipi di cancro, l’identificazione dei marcatori per il loro isolamento affidabile rimane una sfida per diversi tipi di tumore3,4,5,6 , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9.Così, un metodo che non si basa su marcatori molecolari, ma piuttosto sulle proprietà funzionali del TPC (alto auto-rinnovamento e la capacità di crescere in condizioni di basso attaccamento), noto come analisi di formazione della tumorsfera, può essere ampiamente applicato per la l’identificazione dei TPC dalla maggior parte dei tumori. È importante sottolineare che questo saggio può anche essere impiegato per l’espansione dei TPC e quindi applicato direttamente allo screening farmacologico del cancro e agli studi sulla resistenza al cancro1,10.
Il rhabdomyosarcoma (RMS) è una rara forma di sarcoma dei tessuti molli più comune nei bambinipiccoli 11. Althoug RMS può essere identificata istologicamente attraverso la valutazione dell’espressione dei marcatori miogenici, la cellula RMS di origine non è stata caratterizzata in modo univoco a causa dei sottotipi tumorali multipli e dell’alta eterogeneità degli stimoli dello sviluppo tumorale. Ineffetti, studi recenti hanno generato una significativa discussione scientifica sul fatto che RMS sia di origine miogenica o non miogenica, suggerendo che RMS possa derivare da diversi tipi di cellule a seconda del contesto12,13, 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17. Sono stati effettuati numerosi studi sulle linee cellulari RMS utilizzando il saggio di formazione della tumoresfera per l’identificazione delle vie coinvolte nello sviluppo tumorale e nella caratterizzazione dei marcatori associati a popolazioni altamente auto-rinnovate 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21.
Tuttavia, nonostante il potenziale del saggio di formazione della tumorsfera per identificare le cellule RMS di origine, non è ancora stato descritto un metodo affidabile che può essere impiegato nelle cellule RMS primarie. In questo contesto, un recente studio del nostro gruppo ha impiegato un analisi ottimizzata della formazione della tumorsfera per l’identificazione delle cellule RMS di origine in un modello murino Duchenne muscular dystrophy (DMD)22. Più tipi di cellule pre-tumorigene, isolate dai tessuti muscolari, sono testate per la loro capacità di crescere in condizioni di basso attaccamento, consentendo l’identificazione delle cellule staminali muscolari come cellule di origine per RMS in contesti distrofici. Descritto qui è un protocollo riproducibile e affidabile per il saggio di formazione della forma della tumorsferae (Figura 1), che è stato impiegato con successo per l’identificazione di popolazioni cellulari estremamente rare che sono responsabili dello sviluppo del mouse RMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sono stati impiegati diversi metodi per l’isolamento e la caratterizzazione dei TPC dalle popolazioni cellulari eterogenee tumorali: saggi clonogenici tumorali, isolamento FACS e saggio di formazione della tumorsferae. L’asino clonogenico del tumore è stato descritto per la prima volta nel 1971, utilizzato per studi sulle cellule staminali, e solo successivamente applicato alla biologia del cancro29,30. Questo metodo si basa sulla proprietà intrinseca delle cel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Ellison Medical Foundation AG-NS-0843-11, e dal NIH Pilot Grant all’interno del NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199 ad A.S.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
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