Полный трубопровод для изоляции и секвенирования микроРНК и анализа их с помощью инструментов с открытым исходным кодом
Summary
Здесь мы описываем пошаговую стратегию изоляции малых РНК, обогащения микроРНК и подготовки образцов для секвенирования высокой пропускной способности. Затем мы описываем, как обрабатывать последовательность читает и выравнивать их к микроРНК, используя инструменты с открытым исходным кодом.
Abstract
Половина всех человеческих стенограмм, как полагают, регулируется микроРНК. Таким образом, количественные выражения микроРНК может выявить основные механизмы в состоянии болезни и обеспечить терапевтические цели и биомаркеры. Здесь мы подробно описываем, как точно количественно осмотреть микроРНК. Вкратце, этот метод описывает изоляцию микроРНК, привязывая их к адаптерам, пригодным для секвенирования высокой пропускной способности, усилению конечных продуктов и подготовке библиотеки образцов. Затем мы объясняем, как выровнять полученные считывания последовательности с микроРНК шпильками, а также количественно, нормализовать и вычислить их дифференциальную экспрессию. Универсальный и надежный, этот комбинированный экспериментальный рабочий процесс и биоинформатический анализ позволяет пользователям начать с извлечения тканей и закончить с количественной микроРНК.
Introduction
Впервые обнаружен в 1993году 1, в настоящее время оценивается, что почти 2000 микроРНК присутствуют в геноме человека2. МикроРНК представляют небольшие некодивающие РНК, которые, как правило, 21-24 нуклеотидов в длину. Они являются посттранскрипционными регуляторами экспрессии генов, часто связывающимися с дополнительными участками в 3-непереведенном регионе (3-UTR) генов-мишеней для подавления экспрессии белка и деградации мРНК. Количественная микроРНК может дать ценную информацию о экспрессии генов и несколько протоколов были разработаны для этой цели3.
Мы разработали определенный, воспроизводимый и давний протокол для мелкого секвенирования РНК, а также для анализа нормализованных считываний с использованием инструментов биоинформатики с открытым исходным кодом. Важно отметить, что наш протокол позволяет одновременно идентифицировать как эндогенные микроРНК, так и экзогенно доставленные конструкции, которые производят микроРНК-подобные виды, при этом минимизируя считывая эту карту другим малым видам РНК, включая рибосомные РНК ( РНК), передачи РНК-производных малых РНК (tsRNAs), повторных полученных малых РНК, и мРНК продуктов деградации. К счастью, микроРНК 5-фосфорилированных и 2-3 гидроксилированных4, функция, которая может быть использована, чтобы отделить их от этих других небольших РНК и мРНК продуктов деградации. Существует несколько коммерческих вариантов клонирования и секвенирования микроРНК, которые зачастую быстрее и проще в мультиплексе; однако, запатентованные характер реагентов комплекта и их частые изменения делают сравнение проб работает сложной задачей. Наша стратегия оптимизирует сбор только правильный размер микроРНК с помощью акриламида и шагов по очищению агарозного геля. В этом протоколе мы также описываем процедуру выравнивания последовательности считывается на микроРНК с помощью инструментов с открытым исходным кодом. Этот набор инструкций будет особенно полезен для начинающих пользователей информатики, независимо от того, используется наш метод подготовки библиотеки или коммерческий метод.
Этот протокол был использован в нескольких опубликованных исследованиях. Например, он использовался для определения механизма, с помощью которого фермент Dicer расщепляет небольшие ШПильки РНК на расстоянии двух нуклеотидов от внутренней петли структуры стволовой петли – так называемого “правила подсчета петли”5. Мы также следовали этим методам, чтобы определить относительное изобилие доставленных небольших РНК шпильки (SHRNA), выраженных от рекомбинантных адено-ассоциированных вирусных векторов (rAAVs), чтобы определить порог экспрессии shRNA, которые могут быть переновлены до печени токсичность, связанная с избыточным выражением shRNA6. Используя этот протокол, мы также определили микроРНК в печени, которые реагируют на отсутствие микроРНК-122 – высоко выраженной печеночной микроРНК – в то же время характеризуя узор деградации этой микроРНК7. Поскольку мы последовательно использовали наш протокол в многочисленных экспериментах, мы смогли наблюдать за пробными препаратами продольно и видеть, что нет заметных эффектов партии.
При совместном использовании этого протокола, наша цель заключается в том, чтобы позволить пользователям генерировать высокое качество, воспроизводимую количественную оценку микроРНК практически в любой ткани или клеточной линии, используя доступное оборудование и реагенты, а также бесплатные инструменты биоинформатики.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на выявление микроРНК более 20 лет назад13, процесс секвенирования микроРНК остается трудоемким и требует специализированного оборудования, препятствуя лабораториям от регулярного принятия внутренних протоколов14. Другие методы могут одновременно о?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Эндрю Файр и Марка Кей за рекомендации и предложения.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
Riferimenti
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
