Denna artikel innehåller en uppsättning protokoll för utveckling av Human inducerad pluripotenta stamcells-derived cellen (hipsc-cm) nätverk odlade på multispot MEA plattor för att reversibelt elektroporate cellmembranet för åtgärder potentiella mätningar. Inspelningar med hög kapacitet erhålls från samma cell platser upprepade gånger under dagar.
Hjärt säkerhets screening är av största vikt för läkemedels upptäckt och Therapeutics. Därför är utvecklingen av nya hög genomströmning elektrofysiologiska metoder för hipsc-derived cellen (hipsc-cm) preparat välbehövligt för effektiv drogtester. Även om multielektrod matriser (MEAS) används ofta för fält potentiella mätningar av retbara celler, en nyligen publikation av Joshi-Mukherjee och kollegor beskrev och validerade sin ansökan om återkommande åtgärder potentiella (AP) inspelningar från samma hiPSC-CM förberedelse över dagar. Syftet är att tillhandahålla detaljerade steg-för-steg-metoder för seedning av CMs och för mätning av AP-vågformer via elektroporation med hög precision och en temporala upplösning på 1 μs. Denna metod tar upp bristen på lättanvända metoder för att få intracellulär åtkomst för hög genomströmning AP mätningar för tillförlitlig elektrofysiologiska undersökningar. Ett detaljerat arbetsflöde och metoder för plätering av hipsc-CMS på multispot MEA plattor diskuteras betona kritiska steg där det är relevant. Dessutom rapporteras ett specialbyggt MATLAB-skript för snabb datahantering, extraktion och analys för omfattande utredning av våg Forms analysen för att kvantifiera subtila skillnader i morfologi för olika AP-varaktighets parametrar som är inblandade i arytmi och kardiotoxicitet.
Humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (hipsc-CMS) är den gyllene standarden för ett ökande antal laboratorier1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Att slå embryoida kroppar11,12,13 och enskiktslager3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 differentiering är de föredragna metoderna för kardiomyocyte produktion och multielektrod array (MEA) har blivit en gemensam modalitet för övervakning av elektrodynamiken i dessa nät18,19,20. Medan parametrar som kan extraheras från fältpotentialer (FPS) såsom svävningshastighet, amplitud, varaktighet och RR intervall är baslinjen elektrofysiologiska svar på spontant slå enskiktslager18,21, 22,23, de åtgärder potentiella (AP) komponenter bakom dessa extracellulära FP-signaler är svåra att extraräkna24. Vår senaste publikation om upptäckten av en tillämpning av MEAS för direkta återkommande AP mätningar ger bevis på metodik för exemplariska intracellulära AP avläsning med en omfattande vågform analys vid olika repolarisering faser över flera partier av hiPSC-härledda kardiomyocyte nätverk3. I studien visade vi att leveransen av elektroporerande pulser till nätverk av hiPSC-härledda kardiomyocyter möjliggör intracellulär åtkomst för AP-inspelningar. Dessa transienta AP-inspelningar är beroende av transmembranpotentiella återvinningar som observerats genom skadestället3,25,26. Vågformer inspelade via MEA och patch-klämma i vår studie visade liknande AP morfologier därmed validera tillförlitligheten i metoden3.
Några laboratorier har rapporterat Mät APS från olika elektrogena celler med hjälp av specialbyggda MEAS18,21,26,27,28,29, 30, men tillförlitligheten i att använda MEAs för konsekventa och återkommande AP-mätningar bedömdes inte. För närvarande är Gold Standard patch-Clamp teknik begränsad till Terminal Recordings7,31 medan MEA-baserade AP-mätningar är övergående och kan därför utföras flera gånger i samma cell. Vi visar också att man enkelt kan spela in högkvalitativa AP-signaler i millivolt-området som kräver minimal filtrering. Forskarna kan därför inte bara genomföra akuta men också kroniska läkemedels studier i samma preparat med hjälp av MEAs. Dessutom tillåter denna teknik samtidig FP/AP-mätning genererar Electro-Biome bibliotek på kort tid. Med tanke på den ökande betoningen på arytmi prediktion och läkemedelsrelaterade kardiotoxicitet24,32,33,34,35, integration av AP-mätning strategier för att förbättra läkemedelssäkerheten och effektivitets bedömningarna.
Här presenterar vi protokoll för 1) förplätering av nedfrysta hipsc-CMS för mognad, 2) Dissocierande och plätering av hipsc-CMS på multispot MEAS, 3) inspelning av fps och APS från hipsc-cm nätverk, 4) segmentera och extrahera data för analys, och 5) återställa matriser för flera återanvändning. Varje steg har optimerats med betoning på kritiska steg där det är relevant. Krav för cell fäste för att säkerställa en stryk syncytial enskiktslager diskuteras och förfaranden för multispot MEA restaurering för repetitiva elektrofysiologiska studier förklaras. Slutligen, ett anpassat GUI som utvecklats i laboratoriet presenteras för AP signal utvinning, kvalitetssäkring, och segmentering arbetsflöde för att kvantifiera och analysera AP parametrar.
Under årens lopp har tillämpningen av MEAS begränsats till att utföra FP-mätningar av retbara celler för att studera deras elektrofysiologiska egenskaper36,37,38,39. Endast ett fåtal grupper har rapporterat AP-spår från elektrogena celler med hjälp av anpassad MEA-baserad teknik18,29,30. Dessa metoder har dock inte undersökts för upprepade inspelningar från samma preparat. Vi utvecklade en innovativ och exakt metod för att studera APs från samma cell plats över dagar i flera hiPSC-CM nätverk samtidigt3. I vår publicerade studie, en multispot Micro-Gold MEA plattform var anställd för att generera AP vågform bibliotek från flera partier av hipsc-cm kulturer med hög precision och med en temporal upplösning på 1 μs. Det protokoll som beskrivs här förklarar seedning av hiPSC-CMs på matrisen för effektiv utveckling av syncytial CM nätverk för hög genomströmning AP inspelningar. Flera kritiska steg i protokollet är: 1) produktion av flera hög-renhet partier av kvalitetskontrollerat CMS för frysförvaring Banking, 2) mycket livskraftigt post-Tina CMS för förbordning och mognad, 3) behandling av multispot MEA plattan för cm seedning, 4) hiPSC-CM kultur dissociation vid 30 dagar efter differentiering för MONOPLÄTERING, och 5) restaurering av MEAs för flera återanvändning.
Det är viktigt att notera att variation av sats-till-sats i hiPSC differentiering kan påverka experimentella resultat. Den enskiktslager differentierings metoden var optimerad in-House för hög procent kardiomyocyte produktion3,40. FACS analys av MLC2v och TNNT2 markörer av våra kulturer visar en ≥ 90% ventrikulär-liknande fenotyp3. Dessa kvalitetskontrollerade kulturer är kryopreserverade för experimentella studier. Den nuvarande differentierings metoder ger en heterogen blandning av nodal-, förmaks-och ventrikel-liknande celler3,16,17,41. Därför, strategier som används för CM subtyp befolkning berikning kan ytterligare förbättra specificiteten av kulturerna. Dessutom kan vävnadstekniska metoder användas för att förbättra deras mognad. De metoder som föreslås här kan enkelt implementeras för andra CM källor.
De AP-vågformer som registrerats med hjälp av MEA liknade dem som registrerats från nätverk av kardiomyocyter genom optisk mappning42,43, kompletterande metalloxid halvledare-baserad MEA18,21och simulerad AP använda FP Recordings20. För att ta itu med mekanismen för AP-mätningar via MEA Hai och spira25 visade det att elektroporelektrod gränssnitt härma den etablerade skarpa glas mikroelektrod tekniken. Det går dock inte att fastställa vilmembranpotentialen och de sanna amplitudvärdena i vår studie med tanke på att elektroporelektrodgränssnittet i MEA-system inte är kalibrerat och att amplituden är en funktion av känsligheten och upplösningen hos Teknik. Vår strategi delar liknande begränsningar för optisk mappning när det gäller AP-amplitud.
De multispot MEA-baserade FP/AP-utläsningar rapporterade här öppna nya möjligheter för läkemedels säkerhetsbedömning. Även spontant, dessa hipsc-cm enskiktslager Beat i konstant takt. Analys av APD parametrar i flera nätverk ger insikt om elektrisk heterogenitet (figur 13). Omfattande APD-restitutionanalyser måste dock innefatta föregående diastoliska intervaller. Dessutom är högkvalitativa AP-vågformer inspelade från samma cell plats över 96 h (figur 11B) den första rapporten för att spåra membran elektrodynamik över tid som kommer att vara av värde i utveckling och sjukdom.
Det protokoll som beskrivs här för kvantifiering av AP-parametrar kan användas för att generera dos-responskurvor för att testa föreningar. Som nyligen rapporterats av Edwards et al.3, dos svar av noradrenalin, isoproterenol och E 4031 ritas för APD på olika repolarisering faser. Den publicerade studien visade på noggrannheten och tillförlitligheten i tillvägagångssättet för identifiering av de dosberoende subtila förändringarna i AP-vågformerna i realtid. Denna teknik kan lätt förlängas för andra föreningar eller små molekyl bibliotek för att förstå olika elektrofysiologiska svar.
Det MEA-baserade tillvägagångssättet för AP-mätningar som presenteras i denna studie kommer att vara av intresse inte bara för Elektrofysiologer utan även för cellbiologer och in-silico- Modellerare. Vidare, FP/AP inspelningar från samma cell plats på hipsc-CMS gör det möjligt för forskare att generera bioelektriska Databibliotek av brett spektrum av retbara cellulära nätverk inom en kort tidsperiod. Tillgängligheten av dessa resurser kommer att vara värdefullt för läkemedels upptäckter och sjukdomsmodellering.
The authors have nothing to disclose.
Ingen
Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |