В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия
Summary
Эта статья представляет собой полезный анализ in vitro для оценки способности условной среды из опухолевых клеток для привлечения макрофагов.
Abstract
Опухолевые макрофаги (TAMs) составляют большой процент клеток в опухолевой массе для различных видов рака. Глиобластома (ГБМ), злокачественная опухоль головного мозга без лечения, имеет до половины опухолевой массы TAMs. TAMs может быть проопухолевым или противоопухолевым, в зависимости от активации конкретных генов в клетках. Генетические мутации в опухолях, путем регулирования экспрессии цитокинов, могут повлиять на набор TAMs в микросреду опухоли. Здесь мы описываем количественный анализ на основе клеток для оценки набора макрофагов условным средством из опухолевых клеток. Этот анализ использует человеческую линию макрофагов MV-4-11 для изучения притяжения макрофагов условной средой от глиобластомы, что позволяет к высокой воспроизводимости и низкой изменчивости. Данные, генерируемые с помощью этого анализа, могут способствовать лучшему пониманию взаимодействия между опухолью и микроокружением опухоли. Подобный ассс может быть использован для оценки взаимодействия между опухолевыми клетками и другими иммунными клетками, включая Т-клетки и естественные клетки-убийцы (НК).
Introduction
Макрофаги являются иммунными клетками с высокой фенотипической и функциональной неоднородностью1. Они играют важную роль в системах защиты хозяина, ремонт тканей, развитие и прогрессирование опухоли1. TAMs являются макрофагами в микросреде твердых опухолей. Некоторые TAMs может способствовать росту опухоли путем ингибирования Т-клеточной цитотоксичной активности, модулируя микросреду опухоли (TME), способствуя ангиогенез, вторжение и метастазы2,3,4, 5. TAMs являются одними из наиболее распространенных типов клеток в TME и большее количество TAMs обычно коррелирует с хуже выживания пациента во многих типах твердых опухолей6. Различные генетические подписи опухолевых клеток влияют на их способность набирать макрофаги. В GBM, агрессивная опухоль мозга без лечения, макрофаги могут представлять до половины массы опухоли7. Совместное усиление рецептора эпидермального фактора роста(EGFR)и его усечения мутанта EGFRvIII часто наблюдается в ГБМ, что дает преимущества роста опухоли8. Клетки, совместно выражающие EGFR и EGFRvIII, привлекают больше макрофагов посравнению с клетками, выражающими EGFR или EGFRvIII singly 7.
Chemokines представляют собой семейство небольших цитокинов, которые играют значительную роль в регулировании иммунного состава в TME6,9. Клетки человека выражают более 50 цитокинов10. Иммунная инфильтрация в опухолях в значительной степени реализуется путем взаимодействия между цитокинов и цитокиновых рецепторов11. Каждый тип иммунных клеток выражает различные рецепторы хемокина /хемокины и могут быть завербованы клетками, выделяющими специфические хемокины/хемокиновых рецепторы12. Раковые клетки могут увеличить экспрессию некоторых хемокины для вербовки иммунных клеток, таких какTAMs, регулятивные Т-клетки и миелоидные супрессорные клетки (MDSCs) 6. Блокада специфического хемокина, выделяемого опухолями, может быть многообещающим способом ингибирования проникновения иммунных клеток в опухольную массу.
Здесь мы описываем протокол, который позволяет в пробирке оценки взаимодействия опухолево-макрофагов, используя условные средства из опухолевых клеток, содержащих хемокины и макрофаг клеточные линии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе есть несколько ключевых шагов: 1) выбор вставки Transwell. Для MV-4-11 клеточной линии, 5 мкм Transwell вставки хорошо работать. Однако, для других клеточных линий, таких как широко используемая линия моноцитов THP-1, другой размер поры может работать лучше. 2) По мере того как по-разному ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Грантовая поддержка: З. Полученная поддержка от Фонда Лимонада Алекса, Американской ассоциации опухолей головного мозга, NIH T32CA108462 и Программы прорывных биомедицинских исследований, которая частично финансируется Фондом Сандлера. В. Вайс был поддержан грантами NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; Сэмюэл Г. Ваксман онкологический фонд; и председатель Эвелин и Мэтти Андерсон.
Materials
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
Riferimenti
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, (2014).
- Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet. Science. 339 (6117), 286-291 (2013).
- Tsukamoto, H., et al. Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment. Ricerca sul cancro. 78 (17), 5011-5022 (2018).
- Borgoni, S., et al. Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype. Oncoimmunology. 7 (2), e1393596 (2018).
- Argyle, D., Kitamura, T. Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors. Frontiers in Immunology. 9, 2629 (2018).
- An, Z., et al. EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma. Ricerca sul cancro. , (2018).
- Fan, Q. W., et al. EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma. Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).
- Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers. Frontiers in Immunology. 9, 2480 (2018).
- Arimont, M., et al. Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).
- Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).
- Sokol, C. L., Luster, A. D. The chemokine system in innate immunity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).
- Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer. Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).
