Uma linha celular murine baseou o modelo da inibição CDK9 crônica para estudar defeitos não-genéticos difundidos do alongamento do transcriptional (TEdefinitivamente) nos cancros
Summary
O protocolo detalha um modelo in vitro da carcinoma murino do alongamento defeituoso não-genético da transcrição. Aqui, a inibição crônica do CDK9 é usada para reprimar o alongamento produtivo do RNA Pol II ao longo dos genes de resposta pró-inflamatória para imitar e estudar o fenômeno TEdefinitivamente superatendido, presente em cerca de 20% de todos os tipos de câncer.
Abstract
Nós temos relatado previamente que um subconjunto dos cancros é definido por desregulação transcricional globais com deficiências difundidas no alongamento da transcrição do mRNA (te)-nós chamamos tais cancros como tedefinitivamente. Notavelmente, TEdefinitivamente cânceres são caracterizados por transcrição espúria e processamento de mRNA defeituoso em um grande conjunto de genes, tais como INTERFERON/Jak/stat e TNF/NF-κB caminhos, levando à sua supressão. O TEdefinitivamente SubType dos tumores na carcinoma renal da pilha e em pacientes metastáticos da melanoma correlacionou-se significativamente com a resposta e o resultado pobres na imunoterapia. Dada a importância de investigar o tedefinitivamente cânceres — como ele prenuncia um obstáculo significativo contra a imunoterapia — o objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro tedefinitivamente mouse para estudar estes generalizada, não-genética anormalidades transcricional em cânceres e obter novas percepções, novos usos para as drogas existentes, ou encontrar novas estratégias contra esses cânceres. Nós detalham o uso da inibição CDK9 mediada flavopiridol crônica para revogar o fosforilação do resíduo do serina 2 no domínio da repetição do C-terminal (CTD) do polymerase II do RNA (RNA Pol II), suprimindo a liberação de RNA Pol II na transcrição produtiva Alongamento. Dado que o tedefinitivamente os cânceres não são classificados nenhuma mutação somática específica, um modelo farmacológico é vantajoso, e melhor imita os defeitos transcricional e epigenéticas difundidos observados neles. O uso de uma dose subletal otimizada de flavopiridol é a única estratégia eficaz na criação de um modelo generalizável de ruptura generalizada não-genética no alongamento da transcrição e defeitos de processamento de mRNA, imitando de perto o TE clinicamente observado definitivamente características. Conseqüentemente, este modelo de TEdefinitivamente pode ser aproveitado para dissecar, fatores Cell-Autonomous permitindo os em resistir o ataque imune-negociado da pilha.
Introduction
Uma etapa chave-limitando da taxa na expressão de quase todos os genes ativos é a transição do RNA polymerase II (RNA Pol II) do promotor-pausando proximal ao alongamento produtivo1,2. Dado que o desregulação epigenéticas do alongamento transcricional auxilia na progressão de malignidades humanas múltiplas definidas como tedefinitivamente, conduzindo à sinalização suboptimal nos caminhos pró-inflamatórios da resposta que totalizam uma resposta pobre e o resultado à imunoterapia3, o objetivo abrangente deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro útil para estudar estas anomalias transcricional não-genéticas difundidas nos cancros. Nesta luz, o uso da inibição farmacológica crônica de CDK9 é uma estratégia eficaz para criar um modelo generalizáveis do rompimento generalizado não-genético no alongamento da transcrição e em defeitos de processamento do mRNA. A lógica subjacente ao uso da inibição CDK9 crônica é que ela AB roga fosforilação do resíduo de serina 2 no domínio de repetição do C-terminal (CTD) do RNA Pol II, reprisando assim a liberação de RNA Pol II em alongamento produtivo da transcrição. Além disso, TEdefinitivamente cânceres, descritos anteriormente pelo nosso grupo3, não são classificados qualquer mutação somática específica. Conseqüentemente, um modelo não-genético (farmacológico) é vantajoso e melhor imita os defeitos transcricional e epigenéticas difundidos observados neles. O método aqui detalha a geração e caracterização do modelo crônico de tratamento com flavopiridol de células cancerosas murinas. Este método interrompe demonstravelmente o alongamento da transcrição ao longo de genes caracterizados por comprimentos genóricos mais longos, com promotores poizados e expressões induzível tais como TNF/NF-κB e sinalização de interferon/stat, profundamente controlados ao nível de alongamento de transcrição3,4,5. Globalmente, este modelo de linha de célula Murina otimizada de defeitos de alongamento transcricional — o único modelo ao nosso conhecimento para estudar os tumores recém-descritos do TEdefinitivamente — impulsiona a resistência ao ataque imunológico antitumoral, tornando um sistema útil para explorar e examinar as vulnerabilidades de defeitos não genéticos em máquinas de transcrição de núcleo em cânceres vis-à-vis ataque de células imunomediadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O controle de alongamento do RNA Pol II surgiu como uma alavanca decisiva para a regulação da expressão gênica responsiva ao estímulo ao benefício das células malignas5,7,8. Superar o promotor-a pausa proximal ao alongamento e subsequente produção de mRNA requer a atividade da quinase de P-tefb9,10,11. Nosso modelo utiliza flav…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi em parte apoiado por NCI (CA193549) e CCHMC Research Innovation Pilot Awards para Kakajan Komurov, e departamento de defesa (BC150484) prêmio de Navneet Singh. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais do Instituto Nacional do câncer ou do departamento de defesa. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
Riferimenti
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