Protokollen detaljer en in vitro murine kreft modell av ikke-genetisk defekt transkripsjon forlengelse. Her, kronisk hemming av CDK9 brukes til å undertrykke produktive forlengelse av RNA Pol II langs Pro-inflammatorisk respons gener å etterligne og studere klinisk overserved TEdefinitivt fenomen, til stede i ca 20% av alle krefttyper.
Vi har tidligere rapportert at en undergruppe av kreft er definert av global transcriptional deregulations med utbredt mangler i mRNA transkripsjon forlengelse (TE)-vi kaller slike kreftformer som TEdefinitivt. Spesielt, TEdefinitivt kreft er preget av falsk transkripsjon og feil mRNA behandling i et stort sett av gener, som INTERFERON/jak/stat og TNF/NF-KB trasé, fører til deres undertrykkelse. TEdefinitivt under type av svulster i renal celle kreft og metastatisk melanom pasienter signifikant relateres til dårlig respons og utfall i immunterapi. Gitt viktigheten av å undersøke TEdefinitivt kreft-som det portends en betydelig veisperring mot immunterapi-målet med denne protokollen er å etablere en in vitro tedefinitivt mus modell for å studere disse utbredt, ikke-genetiske transcriptional unormalt i kreft og få ny innsikt, romanen bruker for eksisterende rusmidler, eller finne nye strategier mot slike kreftformer. Vi detalj bruk av kroniske flavopiridol mediert CDK9 hemming til oppheve fosforylering av Serine 2 rester på C-terminal gjenta domenet (CTD) av RNA polymerase II (RNA Pol II), undertrykke utgivelsen av RNA Pol II i produktiv transkripsjon forlengelse. Gitt at TEdefinitivt kreft ikke er klassifisert under noen bestemt somatiske mutasjon, en farmakologisk modell er fordelaktig, og best etterligner den utbredte transcriptional og epigenetic defekter observert i dem. Bruken av en optimalisert subletale dose av flavopiridol er den eneste effektiv strategien for å skape en generaliserings modell av ikke-genetisk utbredt forstyrrelse i transkripsjon forlengelse og mRNA behandling defekter, nøye etterligne klinisk observert TE absolutt egenskaper. Derfor denne modellen av TEdefinitivt kan utnyttes til å analysere, celle-autonome faktorer som gjør dem i motstå uimottakelig-mediert celle angrep.
En nøkkel rate-begrenser skritt i uttrykket av nesten alle aktive gener er overgangen av RNA polymerase II (RNA Pol II) fra promoter-proksimale pause til produktiv forlengelse1,2. Gitt at epigenetic feilregulering av transcriptional forlengelse bistår i utviklingen av flere menneskelige ondartet definert som TEdefinitivt, fører til suboptimal signalering i Pro-inflammatorisk respons trasé som beløper til en dårlig respons og utfallet til immunterapi3, det overordnede målet med denne protokollen er å etablere en nyttig in vitro-modell for å studere disse utbredte ikke-genetiske transcriptional unormalt i kreft. I dette lys, bruk av kronisk farmakologisk hemming av CDK9 er en effektiv strategi for å skape en generaliserings modell av ikke-genetisk utbredt avbrudd i transkripsjon forlengelse og mRNA behandling defekter. Begrunnelsen for å bruke kronisk CDK9 hemming er at det opphever fosforylering av Serine 2 rester på C-terminal gjenta domenet (CTD) av RNA Pol II, og dermed repressing utgivelsen av RNA Pol II i produktiv transkripsjon forlengelse. Også, TEdefinitivt kreftformer, beskrevet tidligere av vår gruppe3, er ikke klassifisert under noen bestemt somatiske mutasjon. Derfor, en ikke-genetisk (farmakologisk) modell er fordelaktig og best etterligner utbredt transcriptional og epigenetic defekter observert i dem. Metoden her detaljer generering og karakterisering av kronisk flavopiridol behandling modell av murine kreftceller. Denne metoden påviselig forstyrrer transkripsjon forlengelse langs gener preget av lengre genomisk lengder, med klar arrangører og induserbart uttrykk som TNF/NF-KB og interferon/STAT signalering, dypt kontrollert på nivå med transkripsjon forlengelse3,4,5. Samlet sett er dette optimalisert murine cellelinje modell av transcriptional forlengelse defekter-den eneste modellen til vår kunnskap til å studere den nylig beskrevne TEdefinitivt svulster-stasjoner motstand mot anti-tumor immun angrep, rendering et nyttig system for å utnytte og undersøke sårbarheter av ikke-genetiske defekter i kjernen transkripsjon maskiner i kreft Vis-à-vis immune-mediert celle angrep.
RNA Pol II forlengelse Control har dukket opp som en avgjørende spak for å regulere stimulans-responsive genuttrykk til fordel for ondartede celler5,7,8. Overvinne promoter-proksimale pause til forlengelse og påfølgende mRNA produksjon krever kinase aktivitet av P-TEFb9,10,11. Vår modell benytter flavopiridol (25 nM), en hemmer av …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av NCI (CA193549) og CCHMC Research Innovation pilot Awards til Kakajan Komurov, og Department of Defense (BC150484) prisen til Navneet Singh. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Cancer Institute eller Department of Defense. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
12 well plates | Falcon | 353043 | |
20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
24-well plates | Falcon | 351147 | |
4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
96-well plates | Cellstar | 655180 | |
AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
FBS | Gibco | 45015 | |
Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
IMDM | Gibco | 12440053 | |
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
Tri reagent | Sigma | T9424 | |
Triton | Sigma | T8787-50ML | |
Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
β-ME | G Biosciences | BC98 |