Ex vivo oculomotor skive kultur fra embryonale GFP-udtrykker mus for tidsforskudt billeddannelse af oculomotor nerve outgrowth
Summary
En ex vivo skive analyse tillader oculomotoriske nerve udvækst at blive afbildet i realtid. Udsnit genereres ved at indlejre E 10.5 ISLMN: gfp -embryoner i agopstået, udskæring på en vibratome og vokser i en scene-top inkubator. Axon-vejlednings forløbene vurderes ved at tilføje inhibitorer til kultur medierne.
Abstract
Nøjagtige øjenbevægelser er afgørende for synet, men udviklingen af det okulære motorsystem, især de molekylære veje, der styrer Axon-vejledningen, er ikke fuldt belyst. Dette skyldes til dels de tekniske begrænsninger i de traditionelle Axon-vejlednings assays. For at identificere yderligere Axon-vejlednings signaler, der påvirker oculomotoriske-nerven, er en ex vivo-skive analyse til at afbilde okulomotor nerven i realtid, da den vokser mod øjet, udviklet. E 10.5 ISLMN-gfp- embryoner bruges til at generere ex vivo-skiver ved at indlejre dem i agopstået, udskæring på en vibratome og derefter dyrke dem i en mikroskop fase-top inkubator med tidsforskudt photomicroskopi for 24-72 h. kontroludsnit rekapitulere den in vivo timing af udvækst af axoner fra kernen til kredsløb. Små molekyle hæmmere eller rekombinante proteiner kan tilsættes til kultur medierne for at vurdere de forskellige Axon-vejlednings forløses rolle. Denne metode har fordelene ved at opretholde mere af det lokale mikromiljø, hvorigennem axoner Traverse, ikke axotomizing de voksende axoner, og vurdere axoner på flere punkter langs deres bane. Den kan også identificere effekter på bestemte undergrupper af axoner. For eksempel, hæmning af CXCR4 forårsager axoner stadig inden for midthjernen til at vokse dorsalt snarere end Ventrally, men axoner, der allerede har forladt ventrally påvirkes ikke.
Introduction
Det okulære motorsystem giver et elegant system til undersøgelse af Axon-vejlednings mekanismerne. Det er relativt ukompliceret, bestående af tre kranielle nerver endelser seks ekstrokulære muskler (eoms) som bevæger øjet, og levator palpebrae superioris (LPS), som løfter øjenlåget. Den oculomotoriske nerve innervates LPS og fire EOMs-den ringere skrå og den mediale, ringere, og overlegne rectus femoris muskler. De to andre nerver, trochlear og bortførelser, hver eneste inderverer en muskel, den overlegne skrå og laterale rectus femoris muskel, hhv. Øjenbevægelser giver en nem aflæsning, viser, om innervation var passende, manglende eller afvigende. Derudover, der er menneskelige øjenbevægelser lidelser, der skyldes underskud i neuronal udvikling eller Axon vejledning, kollektivt betegnet de medfødte kranielle disinnervation lidelser (CCDDs)1.
På trods af disse fordele anvendes det okulære motorsystem sjældent i Axon-vejlednings studierne2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10på grund af tekniske ulemper. In vitro Axon vejlednings analyser har mange ulemper11. Co-Culture assays, hvor neuronal bruskeksplantater dyrkes sammen med bruskeksplantater af målvæv12 eller transficeret celler13, afhænger af både symmetri af forklarelsen og præcis positionering mellem forklaren og målvæv. Stripe assays14,15, hvor to stikord er fastlagt i vekslende striber og axoner vurderes for præference vækst på en stribe, kun indikerer, at et substrat er at foretrække frem for den anden, ikke at enten er attraktiv eller repulsiv, eller fysiologisk relevant. Microfluidics kamre kan danne præcise kemiske gradienter, men underkastes voksende axoner til at forskyde stress16,17,18, som kan påvirke deres vækst. Desuden kræver indsamling af bruskeksplantater eller dissocierede celler i hver af disse tilgange, at udvoksede axoner skal axotomiseret, og disse undersøgelser undersøger således faktisk Axon-regenerering i stedet for Initial Axon-udvækst. Endelig, disse in vitro tilgange fjerne det mikromiljø, der påvirker axoner og deres svar på signaler langs forskellige punkter i deres kursus, og traditionelt kun teste en cue i isolation. Sammenblanding af disse ulemper, den lille størrelse af hver kerne i det okulære motorsystem gør dissektion teknisk udfordrende for enten bruskeksplantater eller dissocierede kulturer. Desuden primære kulturer af okulære motoriske neuroner er normalt heterogene, har betydelig celledød, og er tæthed afhængige, der kræver pooling af celler fra flere embryoner (Ryosuki Fujiki, personlig kommunikation). In vivo metoder, dog, herunder knockout musemodeller, er upassende at bruge til screening, i betragtning af den tid og udgifter, der kræves.
Metoder udviklet til kultur hele embryoner19 tillade mærkning af migrerende celler20 eller blokade af specifikke molekyler21, men hele embryo kulturer kræver inkubation i rulle flasker, som udelukker real-time billeddannelse af mærkede Strukturer. Kirurgiske teknikker, der tillader manipulation af embryonet og derefter efterfølgende videre udvikling enten i livmoderen eller i maven af moderen (opretholdelse af placenta forbindelsen)22 er også muligt, men disse giver heller ikke tid-lapse Imaging.
For at overvinde hindringerne for in vitro-assays og muliggøre hurtig screening af signalerings veje blev der udviklet en ex vivo-kultur teknik for embryonale skiver23, der er tilpasset fra en tidligere offentliggjort protokol for perifere nerve udvækst24. Ved hjælp af denne protokol, kan udvikle oculomotoriske nerve blive afbildet over tid i nærværelse af mange af de omgivende strukturer langs dens bane, herunder EOM mål. Ved at tilføje små molekyle hæmmere, vækstfaktorer eller vejlednings signaler til kultur medierne kan vi vurdere vejlednings forstyrrelser på flere punkter langs Axon-forløbet, hvilket giver mulighed for en hurtigere vurdering af potentielle vækst-og vejlednings faktorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne ex vivo Slice-kultur protokol giver betydelige fordele i forhold til traditionelle Axon-vejlednings assays23. Størrelsen af hver kranie motor kerne er ikke en begrænsende faktor, og ingen vanskelig dissektion er nødvendig. Den endogene mikromiljø, hvorigennem axoner rejse vedligeholdes, tillader ændring af en signalering pathway samtidig bevare andre signalering veje. Derudover kan virkningerne vurderes på forskellige punkter langs Axon-forløbet. Da Axon vejledning kræver flere signa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering fra National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute for Child sundhed and Development [U54HD090255], Harvard-vision klinisk videnskabsmand udviklings program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [Career starter Og børnehospitalet oftalmologi Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE er et Howard Hughes Medical Institute investigator.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
Riferimenti
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Biologia dello sviluppo. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Biologia dello sviluppo. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
