Evaluering af gødskning tilstand ved at spore sperm nuklear morfologi i Arabidopsis dobbelt befrugtning
Summary
Vi demonstrerer en metode til at bestemme vellykket eller mislykket befrugtning på grundlag af sædcelle morfologi i Arabidopsis dobbelt befrugtning ved hjælp af et epifluorescens mikroskop.
Abstract
Blomstrende planter har en unik seksuel reproduktion system kaldet ‘ dobbelt befrugtning ‘, hvor hver af sædcellerne præcist sikringer med en ægcelle eller en central celle. Således to uafhængige befrugtning begivenheder finder sted næsten samtidig. Den befrugtede ægcelle og central cellen udvikler sig til henholdsvis zygote og endosperm. Derfor er præcis kontrol af dobbelt befrugtning afgørende for den efterfølgende frøudvikling. Dobbelt befrugtning forekommer i den kvindelige gametofhyte (embryo SAC), som er dybt skjult og dækket med tyk ovule og ovarie væv. Dette tissuevæv konstruktion gør observation og analyse af dobbelt befrugtning ganske vanskeligt og har skabt den nuværende situation, hvor mange spørgsmål vedrørende mekanismen for dobbelt befrugtning forbliver ubesvarede. For den funktionelle evaluering af en potentiel kandidat til befrugtning regulator, fænotypiske analyse af befrugtning er vigtig. At bedømme færdiggørelsen af befrugtning i Arabidopsis thaliana, formerne af fluorescens signaler mærkning sædkerner anvendes som indikatorer. En sædcelle, der undlader at gøde, er indikeret med et kondenseret fluorescens signal uden for de kvindelige kønsceller, hvorimod en sædcelle, der med held befrugte, er indikeret af et dekoncentreret signal på grund af efter med de kvindelige gameter ‘ Nucleus. Den beskrevne metode giver et værktøj til at bestemme vellykket eller mislykket befrugtning under in vivo betingelser.
Introduction
Blomstrende planter producerer frø gennem dobbelt befrugtning, en proces, der er direkte kontrolleret af interaktioner mellem proteiner lokaliseret på gamet plasma membran1,2. Blomstrende plante mandlige gameter, et par sædceller, udvikle i pollen. Et pollen rør, der vokser efter bestøvning leverer et par sædceller til kvindelige gameter, en ægcelle og en central celle, der udvikler sig i en embryo SAC. Efter det mandlige og kvindelige mælke herfra mødes, fremmer proteiner på gamet overfladen genkendelse, fastgørelse og fusion for at fuldføre dobbelt befrugtning. I tidligere undersøgelser blev de mandlige gamet membran proteiner generative celle specifikke 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 og gamet udtrykt 2 (GEX2)5 identificeret som befrugtning regulatorer involveret i gamet fusion og vedhæftet fil. Vi har for nylig identificeret en mandlig gamet-specifikke membran protein, DUF679 Domain membran protein 9 (DMP9), som en befrugtning regulator involveret i gamet interaktion. Vi konstaterede, at et fald i DMP9 ekspression resulterer i signifikant hæmning af ægcelle befrugtning under dobbelt befrugtning i en. thaliana6.
Som dobbelt gødskning forekommer i en embryo SAC, som er indlejret i en ovule, der er yderligere pakket med ovarie væv, er det vanskeligt at observere og analysere de stater, dobbelt gødskning processer. Af denne grund er der stadig mange uklare punkter, der hindrer en fuldstændig forståelse af hele mekanismen for dobbelt befrugtning kontrol. Etableringen af observations teknikker til at spore mælke herfra opførsel under dobbelt befrugtning under in vivo-betingelser er uundværlig for den funktionelle analyse af potentielle kandidater til gødskning regulerende myndigheder. Nylige undersøgelser har givet markør linjer, hvor gamet subcellulære strukturer er mærket med fluorescerende proteiner. I denne artikel viser vi en enkel og hurtig protokol til observation af dobbelt befrugtning, som er forekommet i et embryon, der er afledt af kunstigt bestøverede pisken. Brug sædcelle Nucleus markør linje HTR10-mrfp7, gødskning tilstand af hver kvindelig gamet kan blive diskrimineret på grundlag af sædceller nukleare signal morfologi. Vores protokol med fokus på en sådan morfologisk ændring af sædkerner ved befrugtning kan effektivt opnå en tilstrækkelig mængde data til statistisk bevis. En DMP9-Knockdown-linje med HTR10-mrfp-baggrund (DMP9Kd/HTR10-mrfp) blev brugt som mandlige planter til at vise et enkelt befrugtnings mønster. Protokollen er også velegnet til funktionel analyse af andre gødskning regulerende myndigheder.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mrfp-etiketter faderlige kromatin (dvs. visualiserer sædcelle kerner), og dynamikken i dobbelt befrugtning er blevet rapporteret7. Umiddelbart efter frigivelse fra et pollen rør, er HTR10-mRFP-mærket sædkerner stadig kondenseret. Men hver af sædkerner er dekomprimeret ved sammenlægning med en befrugtet kvindelig gamet kerne i efter tre til fire timer efter gamet membran fusion7. Ikke-befrugtede sædceller forbliver kondenserede, som vist i et embryon, hvor g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for fremme af Science KAKENHI Grant (JP17H05832 til T. I.) og ved finansiering fra det strategiske prioriterede forsknings fremmende program på fytokemiske plante molekyle videnskaber, Chiba University (Japan).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
Riferimenti
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
