Dubbla DNA-linjaler för att studera mekanismen för ribosom Translocation med Ennukleotid upplösning
Summary
Dual DNA linjal assay är utvecklad för att bestämma mRNA position under ribosom translocation, som förlitar sig på dissociation krafterna i den bildade DNA-mRNA duplex. Med single-nucleotide upplösning och förmåga att nå båda ändarna av mRNA, kan det ge mekanistiska insikter för ribosom flyttning och sond andra nukleinsyra förskjutningar.
Abstract
Ribosomen flyttning hänvisar till den ribosomala rörelsen på mRNA av exakt tre nukleotider (NT), som är det centrala steget i proteinsyntesen. För att undersöka dess mekanism finns det två väsentliga tekniska krav. Först är Single-NT upplösning som kan lösa normala flyttning från frameshifting, under vilken ribosom rör sig med andra än 3 NT. Den andra är förmågan att söka både ingångs-och utgångssidor av mRNA för att belysa hela bilden av translocation. Vi rapporterar Dual DNA linjal analys som är baserad på den kritiska dissociation styrkor av DNA-mRNA duplex, som erhållits genom Force-inducerad kvartningar magnetisering spektroskopi (företag). Med 2-4 PN-kraft upplösning är Dual Ruler-analysen tillräcklig för att särskilja olika flyttning-steg. Genom att implementera en lång länkare på sondering DNAs, kan de nå mRNA på motsatt sida av ribosom, så att mRNA position kan bestämmas för båda sidor. Därför är Dual Ruler assay unikt lämpad att undersöka ribosom translocation, och nukleinsyra rörelse i allmänhet. Vi visar representativa resultat som indikerade en loopas mRNA konformation och löst normala flyttning från frameshifting.
Introduction
Biomolekylär förskjutning är en grundläggande parameter i att studera mekanismen för de relaterade biologiska funktionerna. Ett särskilt exempel är ribosom flyttning1,2, under vilken ribosom rör sig med exakt tre nukleotider (NT) på budbäraren RNA (mRNA) normalt, och av en, två eller annat antal NT utom tre i fallet med ramväxling. Därför krävs en molekylära linjalsystem Single-NT-upplösning för att särskilja de olika steg storlekarna. En större utmaning är att söka efter ribosrörelsen på både ingångs-och utgångssidorna. Med andra ord, bara med ett dubbelt linjalsystem kommer vi att kunna avslöja om mRNA är smidigt gängade genom ribosom, eller det finns mellanliggande steg där de två sidorna har olika steg storlekar som leder till en böjd eller loopas mRNA konformation inne i Ribosomen.
Flera metoder har utvecklats för att ta itu med den första utmaningen att lösa olika steg på utgångssidan av ribosom (den 3 ‘ slutet av mRNA). Den Dual luciferas analysen löser olika läsbild ramar genom att mäta förhållandet mellan de resulterande olika proteiner3,4. Det är endast tillämplig för 3 ‘ slutet av mRNA och därmed otillräcklig för att ge en fullständig bild av translocation. Masspektrometri kan analysera de olika peptidfragmenten som en följd av motsvarande kod omordningar5. Men det kan inte peka på hur många NT ribosom rör sig på mRNA. Den Toe-Printing assay är en annan vanlig metod som använder en omvänd transkriptase primas på 3 ‘-distala änden att transkribera mRNA mot ribosom6. Emellertid, det är inte tillämpligt för 5 ‘ slutet av mRNA som går in i ribosom. Andra metoder, inklusive enkel molekyl metoder och fluorescensmetoder7, är svåra att uppnå Single-NT upplösning.
Vi har utvecklat Dual DNA linjal analys som kan unikt bestämma både ingången och utgångs positionerna för den avslöjade mRNA i ribosome-mRNA komplex. Linjalen DNAS är DNA-oligomerer som bildar duplex av bestämda numrerar av basepairs (BP) med mRNAen som avslöjts av ribodelen, oavsett som avslutar av mRNAen. BP siffrorna sedan exakt avslöja ribosom position på mRNA under translocation. BP numrerar av duplex är beslutsamt vid deras kritiska dissociationstyrkor som fås från tvinga-inducerad återstod magnetiseringsspektroskopi (firmor)8. Med 2-3 pN-styrka osäkerhet, de kritiska krafterna är tillräckliga för att erbjuda Single-NT upplösning. Genom att implementera en länkare molekyl på DNA-linjalerna, kan den sterically hindrade sidan av mRNA av Ribosomen vara probed. Olika ribosomal förskjutningar kan thus lösas exakt. Vi har framgångsrikt avslöjat en unik loopas konformation av mRNA fångade av antibiotika under flyttning9, och löst olika läsning ramar som samexisterade på en HAL mRNA sekvens10. Denna artikel beskriver detaljerna i Dual Ruler assay, som omfattar beredning av ribosom komplex, ytfunktionalisering av glaset diabilder, immobilisering av ribosom komplex och deras hybridisering med magnetiskt märkt DNA-linjal magnet detektering och kraftspektrum analys av företag.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vår Dual Ruler assay, de magnetiska pärlor spela två viktiga roller. Först fungerar de som kraftgivare eftersom centrifugalkraften är proportionell mot deras flytande massa. För det andra är pärlorna signal bärare upptäcks av en atomär magnetometer, som för närvarande är den mest exakta magnetiska sensorn. Att kombinera mekanisk manipulation och magnetisk detektering, är att företagen tekniken kan lösa ett stort antal molekylära interaktioner baserat på deras kritiska dissociation styrkor, som är gr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av US National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. bekräftar stöd från Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
Riferimenti
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
