Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16
Summary
Het doel van het protocol is het illustreren van de verschillende assays met betrekking tot virale vermelding die kan worden gebruikt om kandidaat-virale invoer remmers te identificeren.
Abstract
Antivirale testen die de virale binnenkomst mechanisch onderzoeken zijn relevant om te onderscheiden in welke stap de geëvalueerde agenten het effectiefst zijn, en zorgen voor de identificatie van kandidaatvirale invoer remmers. Hier presenteren we de experimentele benaderingen voor de identificatie van kleine moleculen die een infectie kunnen blokkeren door de niet-omhulde Coxsackievirus A16 (CVA16) door de virusdeeltjes of specifieke stappen in de vroege virale invoer te targeten. Assays omvatten de tijd-van-drug-optellen analyse, flow cytometrie gebaseerde virale binding Assay, en virale inactivatie assay. We presenteren ook een moleculair docking protocol dat gebruik maakt van virus capside-eiwitten om potentiële residuen te voorspellen die zijn gericht op de antivirale verbindingen. Deze assays moeten helpen bij de identificatie van de kandidaat-antivirale middelen die op virale binnenkomst handelen. Toekomstige richtingen kunnen deze mogelijke remmers verkennen voor verdere ontwikkeling van de drug.
Introduction
Hand-, voet-en mond ziekte (HFMD) is een ziekte die meestal wordt veroorzaakt door Coxsackievirus A16 (CVA16) en enterovirus 71 (EV71) bij jonge kinderen. Onlangs in de regio Azië-Pacific, is er een belangrijke uptick in CVA16-geïnduceerde HFMD. Terwijl de symptomen kunnen mild zijn, ernstige complicaties kunnen optreden die invloed hebben op de hersenen en het hart, met potentiële fataliteit1,2. Op dit moment zijn er geen gelicentieerde antivirale therapieën of vaccinaties beschikbaar voor CVA16, en daarom is er een dringende behoefte om antivirale strategieën te ontwikkelen om toekomstige uitbraken en de bijbehorende complicaties te beteugelen.
CVA16 is een niet-omhuld virus dat een icosahedrale capside heeft samengesteld van pentamers die elk 4 structurele eiwitten bevatten, namelijk VP1, VP2, VP3 en VP4. Het omcirkelen van elke vijf-voudige as in de pentamer is een ‘ kloof ‘ regio die toont als een depressie en staat bekend om zijn rol in receptor binding3. Aan de onderkant van deze kloof ligt een hydrofoob zak in de VP1 regio die een natuurlijke vette ligand met de naam sfingosine (SPH) bevat. Cellulaire receptoren, zoals Human P selectin glycoproteïne ligand 1 (PSGL-1) en Scavenger receptor klasse B lid 2 (SCARB2), zijn gesuggereerd om een rol te spelen in virale binding door het verplaatsen van deze ligand die resulteert in conformationele veranderingen aan de capside en de daaropvolgende uitwerpen van virale genoom in de ontvangende cel4,5,6. Identificeren van mogelijke remmers die de opeenvolgende gebeurtenissen in de virale entry proces blokkeren zou kunnen bieden potentiële therapeutische strategieën tegen CVA16 infectie.
De stappen in de levenscyclus van het virus kunnen worden ontleed door middel van experimentele benaderingen als doelen om te helpen identificeren van de modus-specifieke antivirale middelen. Een analyse van de tijd van de drug-aanvulling onderzoekt het effect van de drug behandeling op verschillende tijdstippen tijdens de virale infectie, met inbegrip van pre-entry (toegevoegd voorafgaand aan de virus infectie), binnenkomst (toegevoegd gelijktijdig aan de virus infectie), en post-entry (toegevoegd na de virus infectie)7. De impact kan worden beoordeeld aan de hand van een standaard plaque test door het aantal virale plaques dat in elk van de behandelings condities wordt gevormd te kwantificen. De flow cytometrie gebaseerde virale bindings test bepaalt of het medicijn virale gehechtheid aan cellen voorkomt. Dit wordt bereikt door de temperatuur te verschuiven van 37 °C, waarbij de meerderheid van de menselijke virus infecties optreedt, tot 4 °C, waar de virionen kunnen binden aan het hostceloppervlak, maar niet in staat zijn om de cellen7in te voeren. De celmembraan-gebonden virusdeeltjes worden vervolgens gekwantificeerd door middel van immunokleuring tegen virale antigenen en beoordeeld door flow cytometrie. De virale inactivatie test aan de andere kant helpt bij het beoordelen van mogelijke fysieke interacties van het medicijn met vrije virusdeeltjes, het afschermen of neutraliseren van de virionen, of het veroorzaken van aggregaties of conformationele veranderingen die hen inactief maken voor daaropvolgende interacties met het oppervlak van de host-cel tijdens de infectie8,9. In dit experiment mag het virale entmateriaal eerst met het medicijn worden geïnpost voordat het wordt verdund om het geneesmiddel te titreren voorafgaand aan het infecteren van de monolaag van de host-cel en het uitvoeren van een standaard plaque assay8. Tot slot is moleculair docking een krachtig hulpmiddel om mogelijke geneesmiddelinteractie sites op het virion-oppervlak te voorspellen, waaronder de virale glycoproteïnen van omhulde virussen en de virale capside-eiwitten van niet-omhulde virussen, door gebruik te maken van computationele Algoritmen. Dit helpt bij het mechanistisch lokaliseren van de doelstellingen van de werkingsmodus van de drug en bieden nuttige informatie die verder kan worden gevalideerd door downstream assays.
We hebben onlangs de hierboven beschreven methoden gebruikt om antivirale verbindingen te identificeren die een efficiënte geblokkeerde infectie door de niet-omhulde CVA169. Hierin worden de gebruikte gedetailleerde protocollen beschreven en besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit verslag hebben we de protocollen beschreven die nuttig zijn voor de identificatie van antivirale kandidaten die een virus vermelding targeten, met name tegen de niet-omhulde CVA16. De assays zijn ontworpen op manieren om de vroege gebeurtenissen tijdens virale binnenkomst te ontleden, wat nuttig is om het mechanisme (s) van actie en mogelijke doel (en) van de antivirale activiteit van de test agenten te verduidelijken. De ‘ time-of-drug-additie assay ‘ maakt het mogelijk om het potentiële doelwit van de teststoff…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor Dr. Joshua Beckham aan de Universiteit van Texas in Austin voor technische ondersteuning met moleculaire docking. Deze studie werd deels gesteund door de financiering van het ministerie van Wetenschappen en technologie van Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 naar C.-J.L. en L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 en MOST107-2320-B-038-034-MY3 naar L.-T.L.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
Riferimenti
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
