Uso di saggi di ingresso virale e analisi di docking molecolare per l'identificazione di candidati antivirali contro il coxsackievirus A16
Summary
L’obiettivo del protocollo è quello di illustrare i diversi saggi relativi all’ingresso virale che possono essere utilizzati per identificare gli inibitori di ingresso virale candidati.
Abstract
I test antivirali che esaminano meccanicamente l’ingresso virale sono pertinenti a discernere a quale passo gli agenti valutati sono più efficaci e consentono l’identificazione degli inibitori di ingresso virale candidati. Qui presentiamo gli approcci sperimentali per l’identificazione di piccole molecole in grado di bloccare l’infezione da parte del coxsackievirus non avvolto A16 (CVA16) attraverso il targeting delle particelle di virus o passaggi specifici nell’inserimento virale precoce. I saggi includono l’analisi del tempo di aggiunta della droga, il saggio di legame virale basato sulla citometria del flusso e l’analisi dell’inattivazione virale. Presentiamo anche un protocollo di attracco molecolare che utilizza proteine di capside virus per prevedere i potenziali residui presi di mira dai composti antivirali. Questi saggi dovrebbero aiutare nell’identificazione degli agenti antivirali candidati che agiscono sull’ingresso virale. Le direzioni future possono esplorare questi possibili inibitori per un ulteriore sviluppo di farmaci.
Introduction
La malattia della mano, dell’afta epizootica e della bocca (HFMD) è una malattia più comunemente causata dal coxsackievirus A16 (CVA16) e dall’enterovirus 71 (EV71) nei bambini piccoli. Recentemente in tutta la regione Asia-Pacifico, c’è stato un significativo aumento dell’HFMD indotto da CVA16. Mentre i sintomi possono essere lievi, possono verificarsi gravi complicazioni che colpiscono il cervello e il cuore, con potenziale fatalità1,2. Attualmente non sono disponibili terapie antivirali o vaccinazioni autorizzate per CVA16, per cui è urgente sviluppare strategie antivirali per frenare i futuri focolai e le relative complicanze.
CVA16 è un virus non inviluppo che ha un capside icosaedrio assemblato da pentamers che contengono ciascuno 4 proteine strutturali vale a dire VP1, VP2, VP3 e VP4. Intorno ad ogni asse di cinque volte nel pentamer è una regione ‘canyon’ che mostra come una depressione ed è nota per il suo ruolo nel legame recettore3. In fondo a questo canyon si trova una tasca idrofobica nella regione VP1 che contiene un ligando grasso naturale chiamato sphingosine (SPH). I recettori cellulari, come il ligando umano P selectin glicoprotein a 1 (PSGL-1) e il membro di classe B (SCARB2) del recettore scaventro, sono stati suggeriti per svolgere un ruolo nell’associazione virale spostando questo ligando che si traduce in cambiamenti conformazionali al successiva espulsione del genoma virale nella cellula ospite4,5,6. L’identificazione di possibili inibitori che bloccano gli eventi successivi nel processo di ingresso virale potrebbe fornire potenziali strategie terapeutiche contro l’infezione da CVA16.
Le fasi del ciclo di vita del virus possono essere sezionate attraverso approcci sperimentali come obiettivi per aiutare a identificare agenti antivirali specifici della modalità. Un’analisi del tempo di aggiunta di droga esamina l’effetto del trattamento farmacologico in momenti diversi durante l’infezione virale, tra cui l’ingresso preliminare (aggiunto prima dell’infezione da virus), l’ingresso (aggiunto in concomitanza all’infezione da virus) e il post-ingresso (aggiunto a seguito della infezione da virus)7. L’impatto può essere valutato utilizzando un saggio standard della placca quantificando il numero di placche virali formate in ciascuna delle condizioni di trattamento. L’andetto di legame virale basato sulla citometria del flusso determina se il farmaco impedisce l’attaccamento virale alle cellule ospiti. Ciò si ottiene spostando la temperatura da 37 gradi centigradi, alla quale si verifica la maggior parte delle infezioni da virus umani, a 4 gradi centigradi, dove i virioni sono in grado di legarsi alla superficie della cellula ospite ma non sono in grado di entrare nelle cellule7. Le particelle di virus legate alla membrana cellulare vengono quindi quantificate attraverso l’immunostaining contro gli antigeni virali e valutate in base alla citometria di flusso. L’analisi dell’inattivazione virale, d’altra parte, aiuta a valutare le potenziali interazioni fisiche del farmaco con particelle di virus libere, schermaturando o neutralizzando i virioni, o causando aggregazioni o cambiamenti conformazionali che li rendono inattivi per successive interazioni con la superficie della cellula ospite durante l’infezione8,9. In questo esperimento, l’inoculo virale è permesso di incubare prima con il farmaco prima di essere diluito per titolare il farmaco prima di infettare il monostrato della cellula ospite ed eseguire un saggio di placca standard8. Infine, l’aggancio molecolare è un potente strumento per prevedere potenziali siti di interazione farmacologica sulla superficie del virione, tra cui le glicoproteine virali dei virus avvolti e le proteine capside virali da virus non avvolti, utilizzando il computazionale Algoritmi. Questo aiuta a individuare meccanicamente meccanicamente i bersagli della modalità di azione del farmaco e fornire informazioni utili che possono essere ulteriormente convalidate dai saggi a valle.
Recentemente abbiamo impiegato i metodi sopra descritti per identificare i composti antivirali che bloccavano in modo efficiente l’infezione da CVA169 noninvilita. Qui di seguito, i protocolli dettagliati che sono stati utilizzati sono descritti e discussi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto, abbiamo descritto i protocolli che sono utili per l’identificazione di candidati antivirali che prendono di mira l’ingresso virale, in particolare contro il CVA16 non inviluppo. I test sono progettati in modo da sezionare i primi eventi durante l’ingresso virale, il che è utile per chiarire i meccanismi di azione e i potenziali obiettivi dell’attività antivirale degli agenti di prova. Il “saggio del tempo di aggiunta del farmaco” consente di determinare ampiamente il potenziale bersaglio dei compost…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati al Dr. Joshua Beckham presso l’Università del Texas ad Austin per il supporto tecnico con attracco molecolare. Questo studio è stato in parte sostenuto da finanziamenti del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 a C.-J.L. e L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 e MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
Riferimenti
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