पराबैंगनी-सी (यूवी-सी) क्षति के जवाब में प्राथमिक माउस नेत्र सतह कोशिकाओं/स्टेम सेल में ऑक्सीडेटिव क्षति का आकलन
Summary
यह प्रोटोकॉल माउस नेत्र सतह कोशिकाओं से लाइव प्राथमिक संस्कृतियों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), लाइव कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं का एक साथ पता लगाने को दर्शाता है। 2′,7′-डाइक्लोरोफ्लोरेसेसेटेट, प्रोपिडियम आयोडाइड और होचस्ट धुंधला का उपयोग क्रमशः आरओएस, मृत कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं का आकलन करने के लिए किया जाता है, जिसके बाद इमेजिंग और विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
नेत्र सतह विभिन्न पर्यावरणीय कारकों के कारण नियमित रूप से पहनने और आंसू के अधीन है। यूवी-सी विकिरण के संपर्क में एक व्यावसायिक स्वास्थ्य खतरा बनता है। यहां, हम माउस नेत्र सतह से यूवी-सी विकिरण के लिए प्राथमिक स्टेम कोशिकाओं के जोखिम को प्रदर्शित करते हैं। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) गठन ऑक्सीडेटिव तनाव/क्षति की सीमा का readout है । एक प्रयोगात्मक इन विट्रो सेटिंग में, ऑक्सीडेटिव तनाव के कारण उत्पन्न मृत कोशिकाओं के प्रतिशत का आकलन करना भी आवश्यक है। इस लेख में, हम यूवी-सी के 2′,7′-डाइक्लोरोफ्लोरेसेसेटेट (डीसीएफडीए) को प्रदर्शित करेंगे माउस प्राथमिक नेत्र सतह स्टेम सेल और डीसीएफडीए धुंधला की फ्लोरोसेंट छवियों के आधार पर उनकी मात्रा। DCFDA धुंधला सीधे ROS पीढ़ी से मेल खाती है । हम क्रमशः प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) और होचस्ट 3332 और डीसीएफडीए (आरओएस पॉजिटिव) और पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत के साथ एक साथ धुंधला करके मृत और जीवित कोशिकाओं की मात्रा का भी प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
नेत्र सतह (ओएस) मुख्य रूप से कॉर्निया, लैचरीमल ग्रंथि, मेइबोमियन ग्रंथि, कंजक्टिवा, आंखों के ढक्कन मार्जिन और इनरवेशन का हिस्सा है कि1संकेतों को पार करने के बाहरी परत और ग्रंथि एपिथेलिया से बना एक कार्यात्मक इकाई है । पारदर्शी गुंबद के आकार की कॉर्नियल परत रेटिना पर प्रकाश केंद्रित करती है। यह अवास्कुलर ऊतक सेलुलर घटकों जैसे एपिथेलियल कोशिकाओं, केराटोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं और कोलेजन और ग्लाइकोसामिनोग्लिकन2जैसे एककोशिकुलर घटकों से बना है। क्षेत्र आंसू से सूखा है जो अधिकांश पोषक तत्वों की आपूर्ति भी करता है। ओएस की शारीरिक स्थिति इसे बाहरी वातावरण के साथ सीधे संपर्क में होने के लिए मजबूर करती है, अक्सर इसे उज्ज्वल प्रकाश, रोगाणुओं, धूल कणों और रसायनों जैसे विभिन्न कठोर घटकों से उजागर करती है। यह कारक ओएस को शारीरिक चोटों के लिए संवेदनशील बनाता है और इसे विभिन्न बीमारियों का खतरा बनाता है।
ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और एंडोजेनस एंटीऑक्सीडेंट सुरक्षा तंत्र3के उत्पादन के बीच असंतुलन के कारण होता है। आरओएस को प्रतिक्रियाशील अणुओं और मुक्त कणों में वर्गीकृत किया जाता है, जिनमें से दोनों माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन4के माध्यम से आणविक ऑक्सीजन (ओ2)से प्राप्त होते हैं। पूर्व समूह हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2),सिंगल्ट ऑक्सीजन(1O2)जैसी गैर-कट्टरपंथी प्रजातियों से बना है और बाद में सुपरऑक्साइड anions (O2-),और हाइड्रोक्साइल रेडिकल्स(•ओह), अन्य लोगों के बीच जैसी प्रजातियां शामिल हैं। ये अणु सामान्य सेलुलर प्रक्रियाओं के उप-उत्पाद हैं और उनकी भूमिकाओं को सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन, जीन अभिव्यक्ति और मेजबान रक्षा5जैसे महत्वपूर्ण शारीरिक कार्यों में फंसाया गया है। आरओएस का एक बढ़ाया उत्पादन रोगजनक आक्रमण, विद्वेष, और अल्ट्रा वायलेट (यूवी) विकिरण4के संपर्क जैसे कारकों के जवाब में उत्पन्न होने के लिए जाना जाता है। आरओएस के इस अतिउत्पादन के परिणामस्वरूप ऑक्सीडेटिव तनाव होता है जो न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और लिपिड6जैसे अणुओं को नुकसान पहुंचाता है।
प्राकृतिक सूरज की रोशनी, यूवी विकिरण का सबसे प्रमुख स्रोत, यूवी-ए (400-320 एनएम), यूवी-बी (320-290 एनएम), और यूवी-सी (290-200 एनएम)7से बना है। तरंगदैर्ध्य और स्पेक्ट्रल ऊर्जा के बीच एक व्युत्क्रम संबंध की सूचना दी गई है । यद्यपि प्राकृतिक यूवी-सी विकिरण वायुमंडल द्वारा अवशोषित होते हैं, लेकिन कृत्रिम स्रोत जैसे पारा लैंप और वेल्डिंग उपकरण उत्सर्जित होते हैं और इसलिए, एक व्यावसायिक खतरा बनता है। आंखों के संपर्क में आने के लक्षणों में फोटोकेराटाइटिस और फोटोकेराटोकॉन्जुक्टिवाइटिस8शामिल हैं । आरओसी का उत्पादन यूवी प्रेरित सेलुलर क्षतिकोदण्ड देने के प्रमुख तंत्रों में से एक है । वर्तमान अध्ययन में, हम यूवी-सी के संपर्क में आने वाले माउस प्राथमिक नेत्र सतह कोशिकाओं/स्टेम कोशिकाओं में 2′,7′-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफडीए) धुंधला विधि का उपयोग करके आरओ का पता लगाने का प्रदर्शन करते हैं। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हरी फ्लोरेसेंस पर कब्जा कर लिया गया था। कोशिकाओं को क्रमशः जीवित और मृत कोशिकाओं को दाग देने के लिए दो रंगों, Hoechst ३३३४२ और लाल प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ जवाबी दाग थे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित डीसीएफडीए धुंधला विधि यूवी-सी विकिरण के साथ इलाज माउस प्राथमिक नेत्र लाइव कोशिकाओं में आरओ एस के दृश्य सक्षम बनाता है । इस धुंधला विधि का एक लाभ यह है कि यह शोधकर्ताओं को लाइव कोशिकाओं पर यू…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ढांचागत सुविधाओं के लिए येनेपोया रिसर्च सेंटर, येनेपोया (डीम्ड टू डीम्ड टू यूनिवर्सिटी) से समर्थन स्वीकार करते हैं ।
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
Riferimenti
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