紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価
Summary
このプロトコルは、マウスの眼表面細胞からの活性一次培養における活性酸素種(ROS)、生細胞、および死細胞の同時検出を実証する。2′,7′-ジクロロフルオレセインセテート、ヨウ化プロピジウム、ヘーチスト染色を用いてROS、死細胞、生細胞をそれぞれ評価し、続いてイメージングと分析を行います。
Abstract
眼表面は、様々な環境要因により定期的な消耗を受ける。UV-C放射線への暴露は、労働衛生上の危険を構成する。ここでは、マウスの眼面からUV-C線への一次幹細胞の被曝を実証する。活性酸素種(ROS)形成は、酸化的ストレス/損傷の程度の読み出しです。実験的なインビトロ設定では、酸化ストレスのために生成された死細胞の割合を評価することも不可欠です。この記事では、UV-C曝露マウス一次眼表面幹細胞の2′,7′-ジクロロフルオレシンセインテアト(DCFDA)染色とDCFDA染色の蛍光画像に基づく定量を紹介します。DCFDA 染色は直接 ROS 生成に対応します。また、ヨウ化プロピジウム(PI)とヘーヒト3332との同時染色とDCFDA(ROS陽性)およびPI陽性細胞の割合を同時に染色することにより、死細胞と生細胞の定量化を実証した。
Introduction
眼表面(OS)は、角膜の外層及び腺上皮を主成分とする機能ユニットであり、涙腺、筋膜腺、結膜、眼瞼のマージン及び信号を変換するインナーベーションの一部である1。透明ドーム型の角膜層は、光をレーティナに焦点を当てています。この血管組織は、上皮細胞、角質細胞、及び内皮細胞およびコラーゲンおよびグリコサミノグリカンなどの細胞内皮細胞および細胞成分2などの細胞成分から構成される。この地域は、栄養素のほとんどを供給する涙によって排出されます。OSの解剖学的位置は、外部環境に直接接触することを余びれにし、明るい光、微生物、塵の粒子および化学薬品のようなさまざまな粗い部品にそれをしばしば露出させる。この要因は、物理的な傷害にOSを素因とし、それが様々な病気になりやすいです。
酸化ストレスは、活性酸素種(ROS)の生成と内因性抗酸化防御機構3との間の不一平衡に起因する。ROSは反応性分子とフリーラジカルに分類され、いずれもミトコンドリア酸化リン酸化4を介して分子酸素(O2)に由来する。前者の群は、過酸化水素(H2O2)、一重酸素(1O2)などの非ラジカル種から構成され、後者はスーパーオキシドアニオン(O2-)、およびヒドロキシルラジカル(•OH)などの種を含む。これらの分子は、正常な細胞プロセスの副産物であり、その役割は、シグナル伝達、遺伝子発現、および宿主防御5などの重要な生理機能に関与している。ROSの産生の増強は、病原体侵入、異種生物、紫外線(UV)放射線への曝露などの因子に応答して生成されることが知られている4。このROSの過剰産生は、核酸、タンパク質、脂質などの分子の損傷につながる酸化ストレスをもたらす6。
UV 放射の最も主要な光源である自然光は、UV-A (400 ~320 nm)、UV-B (320 ~290 nm)、UV-C (290~200 nm)7で構成されています。波長とスペクトルエネルギーの逆相関が報告されている。自然UV-C放射は大気に吸収されますが、水銀灯や溶接器具などの人工的な光源が放出され、したがって、職業上の危険を構成します。眼への暴露の症状は、光角膜炎および光角結膜炎8を含む。ROSの産生は、UV誘導細胞損傷9を与える主要なメカニズムの1つである。今回の研究では、UV-Cに曝露されたマウスの一次眼表面細胞/幹細胞における2′,7′-ジクロロジハイドロフルオレセインダイアセテート(DCFDA)染色法を用いてROSの検出を実証した。緑色蛍光を蛍光顕微鏡を用いて捕捉した。細胞は、ヘエヒト33342および赤色のヨウ化プロピジウムの2つの染料でカウンター染色し、それぞれ生細胞および死細胞を染色した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するDCFDA染色法により、UV-C線で処理されたマウスの一次眼の生細胞におけるROSの可視化が可能になります。この染色方法の利点は、研究者が生きた細胞に対するUV-C(UVC暴露後3時間)の即時効果と、ROS陽性の割合と死んだ細胞の割合に対する同時列挙を研究できることです。また、染色法が生細胞に用いられているように、細胞は、UV-C放射線の遅延効果の研究のためにより長い時間(?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、インフラ施設に対するイェネポヤ研究センター、イェネポヤ(大学とみなされる)からの支援を認めている。
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
Riferimenti
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Biologia dello sviluppo. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
