Bedömning av oxidativ skada i de primära musokulära ytcellerna/stamcellerna som svar på ultraviolett-C (UV-C) Skada

Summary

Detta protokoll visar samtidig upptäckt av reaktiva syrearter (ROS), levande celler och döda celler i levande primära kulturer från musokulära ytceller. 2′,7′-Diklorfluoresceindiacetate, propidium jodid och Hoechst färgning används för att bedöma ROS, döda celler och levande celler, respektive, följt av bildbehandling och analys.

Abstract

Den okulära ytan utsätts för vanligt slitage på grund av olika miljöfaktorer. Exponering för UV-C-strålning utgör en hälsorisk för arbetsplatsen. Här visar vi exponeringen av primära stamceller från musokulär yta till UV-C-strålning. Reaktiv syreart (ROS) bildning är avläsningen av omfattningen av oxidativ stress/skada. I en experimentell in vitro-miljö är det också viktigt att bedöma andelen döda celler som genereras på grund av oxidativ stress. I den här artikeln kommer vi att visa 2′,7′-Diklorfluoresceceindiacetate (DCFDA) färgning av UV-C exponerade mus primära okulär ytstamceller och deras kvantifiering baserat på fluorescerande bilder av DCFDA färgning. DCFDA färgning motsvarar direkt ROS generation. Vi visar också kvantifieringen av döda och levande celler genom samtidig färgning med propidiumjodid (PI) och Hoechst 3332 respektive och andelen DCFDA (ROS positiva) och PI positiva celler.

Introduction

Den okulära ytan (OS) är en funktionell enhet som huvudsakligen består av det yttre lagret och körtelepithelia av hornhinnan, lachrymal körtel, meibomian körtel, bindhinnan, en del av ögonlockmarginaler och innervations som transduce signaler¹. Den genomskinliga kupolformade hornhinnans skikt fokuserar ljus på näthinnan. Denna akulärvävnad består av cellulära komponenter såsom epitelceller, keratocyter och endotelceller och acellulära komponenter såsom kollagen och glykosaminoglycans². Området dräneras av tårar som också levererar de flesta av näringsämnen. Os anatomiska position tvingar den att vara i direkt kontakt med den yttre miljön, vilket ofta utsätter det för olika hårda komponenter som starkt ljus, mikrober, dammpartiklar och kemikalier. Denna faktor predisponerar OS till fysiska skador och gör det benägna att olika sjukdomar.

Oxidativ stress orsakas på grund av obalansen mellan produktionen av reaktiva syrearter (ROS) och endogena antioxidant försvar mekanismer³. ROS klassificeras i reaktiva molekyler och fria radikaler, som båda härrör från molekylärt syre (O₂) genom mitokondriell oxidativ fosforylering⁴. Den tidigare gruppen består av icke-radikala arter som väteperoxid (H₂O₂), singlet syre⁽¹O₂) och den senare omfattar arter som superoxidanioner (O₂^–) och hydroxylradikaler (^•OH), bland annat. Dessa molekyler är biprodukter av normala cellulära processer och deras roller har varit inblandade i viktiga fysiologiska funktioner såsom signaltransduktion, genuttryck och värdförsvar⁵. En förbättrad produktion av ROS är känt för att genereras som svar på faktorer som patogen invasion, xenobiotika, och exponering för ultraviolett (UV) strålning⁴. Denna överproduktion av ROS resulterar i oxidativ stress som leder till skador av molekyler som nukleinsyror, proteiner och lipider⁶.

Naturligt solljus, den mest dominerande källan till UV-strålning, består av UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) och UV-C (290–200 nm)⁷. Ett omvänt samband mellan våglängden och spektralenergierna har rapporterats. Även om naturliga UV-C-strålning absorberas av atmosfären, avger artificiella källor som kvicksilverlampor och svetsinstrument och utgör därför en yrkesrisk. Symtom på exponering för ögon inkluderar photokeratitis och photokeratoconjunctivit8. Produktion av ROS är en av de viktigaste mekanismerna för att tillfoga UV inducerad cellulära skador⁹. I den aktuella studien visar vi detektion av ROS med hjälp av 2′,7′-Dichlorodifluorescein diacetate (DCFDA) färgning metod i mus primära okulär ytceller / stamceller som exponeras för UV-C. Den gröna fluorescensen fångades med fluorescerande mikroskopi. Celler var motfärgade med två färgämnen, Hoechst 33342 och röd propidium jodid, att färga levande och döda celler, respektive.

Protocol

Experimentet utfördes på primära okulär celler / stamceller som härrör från den schweiziska albino mus öga. Användningen av djur för att skörda ögonen för detta experiment godkändes av Institutional Animal Ethical Committee, Yenepoya (anses vara universitetet) (IEAC-godkännandenummer, 6a/19.10.2016). 1. Beredningar av reagenser Obs: Härledning av primära celler/stamceller från musokulärt ytan ligger utanför ramen för detta protokoll. Därför visa…

Representative Results

DCFDA är ett färglöst färgämne som är en kemiskt minskad form av fluorescein som används som en indikator för att upptäcka ROS i celler. Detta färgämne fastnar inuti celler och oxideras lätt till fluorescerande dichlorodihydrofluorescein (DCF), som avger en grön fluorescens. Denna fluorescens kan detekteras med fluorescerande mikroskopi. Cellerna kan visualiseras och korreleras med ROS ackumulering enligt följande: (i) levande celler utan ROS avger hög blå fluorescens; ii) Levande celler med ROS-ansamling…

Discussion

DCFDA färgning metod som beskrivs här möjliggör visualisering av ROS i mus primära okulär levande celler behandlas med UV-C strålning. En fördel med denna färgning metod är att det också tillåter forskarna att studera de omedelbara effekterna av UV-C (3 timmar efter UVC exponering) på levande celler och deras samtidiga uppräkning för andelen ROS positiva, liksom, döda celler. Dessutom, eftersom färgningsmetoden används på levande celler, cellerna kan ytterligare inkuberas i samma media under en längre…

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad