قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق
Summary
ويشكل الانتشار جزءا هاما من الوظيفة الخلوية ، وقراءه مشتركه تستخدم لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ولذلك ، فان قياس الانتشار هو فحص يستخدم بكثرة في بيولوجيا الخلايا. نقدم هنا طريقه بسيطه ومتنوعة لقياس الانتشار يمكن استخدامها في الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة.
Abstract
قدره الخلية علي التكاثر جزء لا يتجزا من الوظيفة العادية لمعظم الخلايا ، وخلل الانتشار هو في قلب العديد من عمليات المرض. ولهذه الأسباب ، فان قياس الانتشار أداه مشتركه تستخدم لتقييم وظيفة الخلية. ويمكن قياس تكاثر الخلايا ببساطه عن طريق العد ؛ ومع ذلك ، فان هذه وسيله غير مباشره لقياس الانتشار. أحدي الوسائل الشائعة للكشف المباشر عن الخلايا التي تستعد للتقسيم هي عن طريق دمج النظير النيونوسايد المسمي. وتشمل هذه التناظرية النيونوسايد المشعة 3ح-thymidine بالاضافه إلى النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ‘ ديوكسيريدين (brdu) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو). يتم الكشف عن تاسيس EdU بالنقر علي الكيمياء ، والتي لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع BrdU. وفي هذا التقرير ، نقدم بروتوكولا لقياس الانتشار بدمج النظام التعليمي. ويتضمن هذا البروتوكول خيارات لمختلف القراءات ، إلى جانب مزايا ومساوئ كل منها. ونناقش أيضا الأماكن التي يمكن فيها تحسين البروتوكول أو تغييره لتلبيه الاحتياجات المحددة للتجربة المخطط لها. وأخيرا ، فاننا نلمس الطرق التي يمكن بها تعديل هذا البروتوكول الأساسي لقياس نواتج أيض الخلايا الأخرى.
Introduction
الانتشار هو جزء هام من الوظيفة الخلوية1،2. السيطرة علي الانتشار يؤثر علي العمليات العادية مثل التنمية ، والعمليات المرضية مثل السرطان وامراض القلب والاوعيه الدموية. فرط النمو من خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية, علي سبيل المثال, ويعتقد ان تكون مقدمه لتصلب الشرايين3. وتستخدم أيضا التغيرات في انتشار الخلايا لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ونظرا لتاثيرها الواسع النطاق ، فان قياس الانتشار هو عماد العديد من المختبرات القائمة علي بيولوجيا الخلايا.
ويمكن قياس تكاثر الخلايا بمجرد عد الزنزانات إذا كان عدد سكان الخلية من الفائدة يقسم بسرعة إلى حد ما. بالنسبة للخلايا البطيءه النمو ، قد تكون عمليات عد الخلايا اقل حساسية. وغالبا ما يقاس الانتشار بإدماج النظير المسمي النيونوسايد. علي الرغم من ان معيار الذهب هو 3H-التاسيس thymidine, العديد من المختبرات الابتعاد عن هذه الطريقة نظرا لتوافر البدائل الأحدث, غير المشعة. وتشمل هذه الاصباغ الفلورية الخلوية ، والكشف عن دوره الخلايا البروتينات المرتبطة بها ، ودمج النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ‘ ديوكسيريدين (BrdU) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو)4.
الاصباغ الخلوية ، مثل كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات النجاح استر (cfse) ، والكشف عن انتشار لان كثافة نصفين الصبغة في كل مره يقسم الخلية5. ويشيع استخدام هذه التقنية في التدفق الخلوي للخلايا غير الملتصقة. لم يتم استخدامه كثيرا للخلايا الملتصقة ، ولكن مع الجيل الجديد من قراء لوحه التصوير قد يتغير هذا. وغالبا ما يستخدم الكشف عن البروتينات المرتبطة بدوره الخلية من خلال التقنيات القائمة علي الأجسام المضادة (قياس التدفق الخلوي ، مناعي ، الخ) للانسجه أو الخلايا غير الملتصقة. يجب ان تكون هذه الخلايا/الانسجه ثابته وتتخللها قبل تلطيخ. النظائر النيونوسيد BrdU و EdU متشابهة في النهج إلى 3H-الثيميدين ، ولكن من دون إزعاج من النشاط الإشعاعي. يتم الكشف عن دمج BrdU من قبل الأجسام المضادة BrdU ، التالي يجب ان تكون ثابته الخلايا وتتخللها قبل تلطيخ. الاضافه إلى ذلك ، يجب ان تعامل الخلايا مع DNase لفضح مرضبه BrdU.
يتم الكشف عن تاسيس EdU عن طريق النقر الكيمياء ، والتي المجموعات الالكيد وأزيد “انقر” معا في وجود النحاس الحفاز. يمكن لأي من المجموعتين ان تكون بمثابه الجزيء الحيوي المدمج أو جزيء الكشف4. النظائر النيونوسيد المتاحة تجاريا لديها مجموعه الالكاين المرفقة. بالنسبة لاختبارات الانتشار ، لذلك ، يتم الكشف عن التناظرية الوظيفية الالكالي الجانبية من قبل أزيد مترافق إلى صبغه فلورية أو علامة أخرى. دمج التعليمية له العديد من المزايا علي BrdU. أولا ، لأنه لم يتم العثور علي المجموعات الكيميه والأزيد في خلايا الثدييات ، وهذا التفاعل هو محدده للغاية مع خلفيه منخفضه6. لان كلا المجموعتين صغيره ، الخلايا لا تحتاج إلى الخضوع لمسخ الحمض النووي لفضح التناظرية النونوزيد كما هو مطلوب ل BrdU7. وأخيرا ، انقر فوق الكيمياء هو تنوعا للغاية ، ويمكن استخدامها لوضع العلامات الايضيه من الحمض النووي ، RNA ، البروتين ، الأحماض الدهنية ، والكربوهيدرات8،9،10،11. إذا كان الهدف الأيضي المسمي الفائدة علي سطح الخلية ، يمكن تسميه الخلايا الحية12. الاضافه إلى ذلك ، يمكن معالجه الخلايا لتلطيخ النيون المناعي مع الأجسام المضادة.
يصف البروتوكول التالي استخدام التاسيس EdU وانقر فوق الكيمياء لقياس الانتشار في خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية (الشكل 1). نعرض ثلاث طرق مختلفه لدمج ايدو يمكن قياسها ، والنتائج التمثيلية من كل منها ، ومزاياها وعيوبها. قياس الانتشار عن طريق النقر بالكيمياء مفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة والبطيءه النمو. الاضافه إلى ذلك ، يتم الحفاظ علي مورفولوجية الخلية بشكل جيد ويمكن أيضا تلطيخ المضادة للأجسام التي تقوم بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
دمج التعليمية هو وسيله بسيطه ومباشره لقياس انتشار الخلايا. ومن المفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة13. بروتوكولنا يستخدم خلايا العضلات الملساء ، ولكنه ينطبق علي اي خليه ملتصقة (الظهاريه ، بطانية ، الخ). علي الرغم من ان البروتوكول ليس معقدا ، فان الخطوة الحاسمة الواحدة هي صنع حل وضع…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كاتي كارول علي المساعدة الفنية. كما نشكر الدكتور ديفيد كول ومختبر تحليل البروبروتيميكس لتعليم وتوفير قارئ لوحه التصوير الخلوي. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من مؤسسه رايت ستيت (إلى L.E.W.).
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Riferimenti
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. . Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
