इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य स्थानीय रूप से खरीदे गए खाद्य पदार्थों में विभिन्न क्लोस्ट्रिडियम perfringens toxins का पता लगाने के लिए है, विशेष रूप से एप्सिलॉन विष तनाव प्रकार बी और डी का उत्पादन, अवायवीय कक्षों के उपयोग के बिना.
क्लोस्ट्रिडियम perfringens (सी perfringens) एक विपुल विष उत्पादक है और विभिन्न मेजबानों में रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बनता है. C. perfringens पांच अलग toxinotypes में वर्गीकृत किया गया है, ए के माध्यम से ई, चार प्रमुख विष जीन की गाड़ी पर आधारित है. प्रसार और इन विभिन्न toxinotypes के वितरण understudied है, विशेष रूप से अमेरिकी खुदरा भोजन में उनकी व्यापकता. हमारे लिए विशेष रुचि के प्रकार बी और डी उपभेदों, जो एप्सिलॉन विष का उत्पादन कर रहे हैं, एक अत्यंत घातक विष मनुष्यों में एकाधिक काठिन्य के पर्यावरण ट्रिगर होने का सुझाव दिया. विभिन्न खाद्य नमूनों में विभिन्न सी perfringens toxinotypes की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए, हम चुनिंदा एक अवायवीय कंटेनर प्रणाली केवल तीन culturing कदम शामिल के उपयोग के बिना इन बैक्टीरिया संस्कृति के लिए एक आसान तरीका विकसित की है. खाद्य स्थानीय किराने की दुकानों से खरीदा है और परिवेश की स्थिति के तहत प्रयोगशाला में ले जाया जाता है। नमूनों कीमा बनाया जाता है और संशोधित तेजी से perfringens मीडिया (आरपीएम) में inoculated और एक सील, airtight शंकु ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर incubated. रात भर संस्कृतियों ठोस Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) agar के एक नीचे की परत पर inoculated रहे हैं, और फिर पिघला हुआ TSC agar के एक शीर्ष परत के साथ मढ़ा, एक “सैंडविच”, अवायवीय वातावरण बनाने. आगर प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट किया जाता है और फिर काले, सल्फाइट-कम करने वाली कालोनियों की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया जाता है। सी perfringens-संदिग्ध कालोनियों बाँझ आंख droppers का उपयोग कर TSC आगर से हटा रहे हैं, और RPM में inoculated और एक airtight शंकु ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उप संस्कृति. डीएनए RPM subculture से निकाला जाता है, और फिर C. polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के माध्यम से विष जीन perfringens की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया. नमूने के प्रकार के आधार पर, आम तौर पर 15-20% नमूने सी perfringensके लिए सकारात्मक परीक्षण .
क्लोस्ट्रिडियम पर्फ्रिंग्स (सी. perfringens) एक ग्राम सकारात्मक, अवायवीय, बीजाणु बनाने, रॉड आकार जीवाणु है कि पर्यावरण में सर्वव्यापी पाया जाता है. बैक्टीरिया की इस प्रजाति में ऐसे जीन होते हैं जो 17 से अधिक विषाक्त पदार्थों के लिए सांकेत: सांकेत: बदलते हैं और ऐतिहासिक रूप से चार अलग-अलग विष जीनों की उपस्थिति के आधार पर पांच विष-प्रकार (ए-ई) में पहचाने जाते हैं: अल्फा, बीटा, एप्सिलॉन, और जरा विष(तालिका 1)1. हाल ही में, यह सुझाव दिया गया है कि इस टाइपिंग-स्कीम को प्रकार एफ और जी को शामिल करने के लिए विस्तारित किए जाने की आवश्यकता है, जो सी perfringens enterotoxin (सीपीई) और NetB विष, क्रमशः2बंदरगाह. हालांकि, इस sheming प्रणाली औपचारिक रूप से स्वीकार किया जाता है इससे पहले कि और अधिक शोध की जरूरत है. जबकि अल्फा विष जीन सख्ती से गुणसूत्रीय स्थित है, सीपीई जीन गुणसूत्र और प्लाज्मिड दोनों पर पाया जा सकता है। तुलना में, शेष विषाक्त पदार्थों ‘जीन विभिन्न अलग आकार प्लाज्मिड पर पाए जाते हैं. हम विशेष रूप से सी perfringens प्रकार बी और डी के प्रसार में रुचि रखते हैं के रूप में इन उपभेदों एप्सिलॉन विष का उत्पादन, एक अत्यंत शक्तिशाली, छिद्र बनाने विष, जो एकाधिक स्क्लेरोसिस ट्रिगर में एक भूमिका निभाने का सुझाव दिया गया है (एमएस) मनुष्यों में3 ,4,5,6,7. कैसे लोगों को संक्रमित हो या इन उपभेदों से उपनिवेश अज्ञात है. एक संभव विवरण दूषित खाद्य उत्पादों की खपत के माध्यम से है. इस सवाल का जवाब देने में मदद करने के लिए, हम विभिन्न सी अमेरिकी खाद्य नमूनों में toxinotypes perfringens की व्यापकता निर्धारित करने की मांग की.
अमेरिकी खाद्य नमूनों में सी perfringens toxinotypes की उपस्थिति understudied है और अक्सर अवायवीय कंटेनर प्रणालियों और कई उप-कुलिंग कदम8,9,10,11 के उपयोग की आवश्यकता है . हालांकि कई उप-पलिंग कदम शुद्ध अलग प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं, इस विधि समय12,13,14के साथ प्लाज्मिड की हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं , संभवतः प्लाज्मिड जनित विष जीन का पता लगाने को प्रभावित एप्सिलॉन विष जीन सहित. हम एक आसान विधि विकसित करने की मांग की, कम उप-कुलिंग कदम के साथ, चुनिंदा संस्कृति सी perfringens अवायवीय कक्षों, जार, या बैग के उपयोग के बिना. संक्षेप में, खाद्य नमूनों को रैपिड परफ्रिंग्स मीडिया (आरपीएम) रात भर (ऑन) में टीका लगाया जाता है, फिर टीएससी आगर में “सैंडविच” और इनक्यूबेट ऑन। सी perfringens होने का संदेह कालोनियों तो RPM में उप-संस्कृति और फिर से पर incubated कर रहे हैं. डीएनए निकाला जाता है और पीसीआर जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए किया जाता है (चित्र 1)। हम RPM का उपयोग करने के लिए चुना है के रूप में यह अन्य अधिक मानक मीडिया15की तुलना में खाद्य नमूनों से सी perfringens उपभेदों की वसूली में वृद्धि करने के लिए प्रदर्शन किया गया है . इसके अलावा, RPM सफलतापूर्वक एक एमएस रोगी से एक epsilon विष उत्पादन प्रकार बी तनाव को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था4. हम आसान डीएनए निष्कर्षण की अनुमति देने के लिए मूल संस्करण के बजाय RPM का एक संशोधित संस्करण का उपयोग करें। हालांकि इस विधि के नमूनों के भीतर विष जीन की आसान पहचान की अनुमति देता है, यह संभव है कि एक व्यक्ति के नमूने में एक से अधिक सी perfringens toxinotype शामिल होंगे. क्योंकि हमारी विधि शुद्धीकरण के कई दौर का उपयोग कर शुद्ध उपभेदों को अलग नहीं करता है, एक नमूने से कई toxinotypes की पहचान संभव नहीं है. हालांकि, मानक शुद्धि तकनीक (आमतौर पर टीएससी प्लेटों या रक्त agar प्लेटों पर लकीर) शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल के अंत में लागू किया जा सकता है.
यहाँ हम सीमित subculturing के साथ खुदरा खाद्य नमूनों में और एक अवायवीय कक्ष प्रणाली के उपयोग के बिना सी perfringens प्रसार की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि के खाद्य नमूनों से सी perfringens की पहचान बढ़ाने के लिए तकनीकों का एक संयोजन का उपयोग करता है. RPM मीडिया के एक संशोधित संस्करण का उपयोग करके, हम C. perfringensके चयनात्मक विकास के लिए अनुमति देते हैं। टीएससी आगर की परतों के बीच में टीका कृतिक आरपीएम को सैंडविच करके, हम सी perfringensकी विशेषता अवायवीय, सल्फाइट कम करने वाले बैक्टीरिया की पहचान करने और उन्हें अलग करने में सक्षम हैं। सी perfringensकी उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, सल्फाइट कम कालोनियों ताजा RPM में उप-संस्कृति रहे हैं। संशोधित संस्करण या RPM हमें आसानी से संस्कृतियों से डीएनए निकालने के लिए अनुमति देता है, विशिष्ट विष जीन की पीसीआर पुष्टि को सक्षम करने. सी perfringens दूषित खाद्य नमूनों की पुष्टि तीन दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है.
प्रारंभिक प्रयोगों में, खाद्य नमूनों बस आरपीएम और डीएनए पर संस्कृतियों से निकाले में inoculated थे. इस विधि के परिणामस्वरूप नमूनों की सीमित संख्या में C. perfringens का पता लगाने के परिणामस्वरूप (डेटा नहीं दिखाया गया). यद्यपि RPM C. perfringens वृद्धि के लिए चयनात्मक है, यह C. perfringens वृद्धि के लिए अनन्य नहीं है। अन्य, ग्राम सकारात्मक, डी-साइकॉल्सरीन प्रतिरोधी बैक्टीरिया अभी भी आरपीएम में विकसित हो सकते हैं। हम hypothesized है कि अन्य जीवाणु प्रजातियों द्वारा संदूषण हमारी पहली ON RPM संस्कृति में हमारे पीसीआर विश्लेषण की संवेदनशीलता को कम करके सी perfringens उपभेदों के हमारे पता लगाने में कमी आई है हो सकता है. सी perfringens का पता लगाने को बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण कदम TSC agar “सैंडविच” तकनीक का समावेश किया गया था. यह हमें अंतर करने के लिए अनुमति दी और अवायवीय, सल्फाइट कम कालोनियों, सी perfringens की विशेषता के लिए चयन करें. इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि पिघला हुआ टीएससी आगर की शीर्ष परत 40 डिग्री सेल्सियस पर है। हालांकि कुछ सी perfringens उपभेदों वृद्धि हुई तापमान पर विकसित कर सकते हैं (46-48 डिग्री सेल्सियस)15,16, बढ़ी हुई तापमान पर पिघला हुआ आगर के अलावा बहुत बरामद संस्कृतियों की मात्रा कम कर देता है, ज्यादातर सेल मौत के कारण होने की संभावना .
इस विधि के लिए कई संभावित सीमाएँ हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, न तो आरपीएम और न ही टीएससी आगर विशेष रूप से सी perfringens के लिए चयन करता है या अंतर करता है, खाद्य नमूनों में मौजूद अन्य जीवाणु प्रजातियों के विकास के लिए अनुमति देता है। यह केवल C. perfringens के लिए चयन करने के लिए परख की संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं. हालांकि, यह लगभग सभी culturing तकनीकों में एक आम सीमा है. शुद्ध अलग की जीनोटाइपिंग पुष्टि निश्चित रूप से सी perfringens और अन्य जीवाणु प्रजातियों की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है। इस अध्ययन की एक और सीमा यह है कि हम शुद्ध अलग परीक्षण नहीं है. हम जानबूझकर यह subculturing की मात्रा को सीमित करने के लिए किया था, के रूप में बार-बार subculturing प्लाज्मिड नुकसान में परिणाम की आशंका है. क्योंकि हम शुद्धता के लिए अलग नहीं है, यह संभव है कि कई सी perfringens toxinotypes एक ही नमूना या subculture में मौजूद हो सकता है. यदि शोधकर्ताओं को शुद्ध अलग प्राप्त करना चाहते हैं, मानक शुद्धि विधियों पिछले RPM संस्कृति इस विधि में वर्णित पर इस्तेमाल किया जा सकता है; यह आम तौर पर अवायवीय कक्षों के उपयोग की आवश्यकता है. हालांकि मूल रूप से भोजन से C. perfringens को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया, इस विधि की पहचान करने और सी स्रोतों की एक भीड़ से perfringens को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विशेष रूप से, इस विधि का एक ऐसा ही अनुप्रयोग मनुष्यों (या जानवरों) से मल के नमूनों का परीक्षण करना है जो संक्रमण के स्रोत को बेहतर ढंग से समझने के लिए बैक्टीरिया को सी perfringens और toxinotype से संक्रमित होने का संदेह है।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को सार्वजनिक, वाणिज्यिक, या नहीं लाभ क्षेत्रों के लिए से कोई विशिष्ट धन प्राप्त नहीं किया.
D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
Dry Incubator | any brand | ||
Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
Individual Primers | Invitrogen | ||
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
microcentrifuge tube | any brand | ||
parafilm or plastic wrap | any brand | ||
Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
Sterile Cell Scraper | any brand | ||
Sterile cell Spreader | any brand | ||
Sterile petri dishes | any brand | ||
Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
table top centrifuge | any brand | ||
Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
water bath | any brand | ||
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |