इस प्रक्रिया में, एक DsRed आधारित epitope ligand कच्चे संयंत्र के अर्क या सेल संस्कृति supernatants से monoclonal एंटीबॉडी के कब्जा करने के लिए एक अत्यधिक चयनात्मक आत्मीयता राल का उत्पादन करने के लिए स्थिर है, प्रोटीन ए के लिए एक विकल्प के रूप में.
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) की शुद्धि आमतौर पर प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा हासिल की जाती है, जो समग्र प्रक्रिया लागत के 25% तक के लिए जिम्मेदार हो सकती है। वैकल्पिक, लागत प्रभावी कब्जा कदम इसलिए औद्योगिक पैमाने पर विनिर्माण, जहां एक एकल mAb की बड़ी मात्रा में उत्पादन कर रहे हैं के लिए मूल्यवान हैं. यहाँ हम एक DsRed आधारित epitope ligand के स्थिरीकरण के लिए एक विधि प्रस्तुत करने के लिए एक पार से जुड़े agarose राल प्रोटीन ए का उपयोग किए बिना कच्चे संयंत्र के अर्क से एचआईवी-neutralizing एंटीबॉडी 2F5 के चयनात्मक कब्जा करने की अनुमति. रैखिक epitope ELDKWA पहले आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन DsRed करने के लिए जुड़े थे और संलयन प्रोटीन ट्रांसजेनिक तंबाकू में व्यक्त किया गया था (Nicotiana Tabacum) पौधों स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध करने से पहले. इसके अलावा, सक्रिय पार से जुड़े agarose पर आधारित एक विधि उच्च लिगंड घनत्व, कुशल युग्मन और कम लागत के लिए अनुकूलित किया गया था। पीएच और बफर संरचना और घुलनशील लिगंड एकाग्रता युग्मन प्रक्रिया के दौरान सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर थे, जो एक डिजाइन के प्रयोग में सुधार किया गया था-प्रयोग दृष्टिकोण. जिसके परिणामस्वरूप आत्मीयता राल चुनिंदा एक कच्चे संयंत्र निकालने में लक्ष्य माब बाँध करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया था और elution बफर उच्च माब वसूली, उत्पाद गतिविधि और आत्मीयता राल स्थिरता के लिए अनुकूलित किया गया था. विधि आसानी से रैखिक प्रतीक के साथ अन्य एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. नई रेजिन प्रोटीन ए की तुलना में कोमल elution शर्तों की अनुमति देते हैं और भी mAb उत्पादन के लिए एक प्रारंभिक कब्जा कदम की लागत को कम कर सकता है.
दवाकी लगभग हर शाखा में रोगों के व्यापक स्पेक्ट्रम के उपचार के लिए जैव-औषधि उत्पाद महत्वपूर्ण हैं . मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) biopharmaceutical बाजार पर हावी है, दुनिया भर में बिक्री के साथ 20202में लगभग 110 अरब डॉलर तक पहुँचने की उम्मीद है. mAbs के लिए इष्ट अभिव्यक्ति मंच चीनी हम्सटर अंडाशय सेल लाइनों, जो आम तौर पर संस्कृति supernatant3,4में 10 जी $एल-1 तक की उच्च mAb titers का उत्पादन कर रहे हैं. तथापि, स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों में mAbs का उत्पादन मध्यम की उच्च लागत और बाँझ किण्वन5की आवश्यकता के कारण महंगा है। वैकल्पिक अभिव्यक्ति प्लेटफार्मों जैसे पौधों संभावित औद्योगिक विनिर्माण के लिए एक तेज, सरल, कम महंगा और अधिक स्केलेबल दृष्टिकोण प्रदान करतेहैं 6,7.
स्तनधारी सेल संस्कृतियों के साथ जुड़े लागत के अलावा, उत्पाद पर कब्जा करने के लिए प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का व्यापक उपयोग mAbs के औद्योगिक उत्पादन के लिए एक प्रमुख लागत ड्राइवर है। प्रोटीन ए स्वाभाविक रूप से स्टेफिलोकोकस ऑरियस कोशिकाओं की सतह पर पाया जाता है और यह कुछ मौरीन और मानव एंटीबॉडी के टुकड़े क्रिस्टलीय (एफसी) क्षेत्र को बांधता है, जिससे हास्य प्रतिरक्षा प्रणाली से बचने के लिए एक रक्षा तंत्र के रूप में कार्यकरताहै 8। प्रोटीन ए सेल संस्कृति supernatants से mAbs के कब्जा करने के लिए उद्योग सोने के मानक बन गया है और यह भी व्यापक रूप से अनुसंधान समुदाय द्वारा प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह अत्यधिक चयनात्मक है, आम तौर पर एक ही कदम8में 95% की mAb शुद्धता को प्राप्त करने . आश्चर्य की बात है कि पिछले दो दशकों में प्रोटीन ए की बिक्री ने mAbs8की बिक्री को बारीकी से प्रतिबिंबित किया है। उत्पादन पैमाने पर निर्भर करता है, प्रोटीन ए की लागत कुल प्रक्रिया लागत का 25% से अधिक के अनुरूप है और इस तरह चिकित्सीय mAbs, जो 2,000 जी-15,9तक हो सकता है के बाजार मूल्य को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, एक समान शुद्धि प्रदर्शन के साथ वैकल्पिक क्रोमैटोग्राफी रेजिन के लिए काफी हद तक उत्पादन लागत को कम करने की क्षमता है, एंटीबॉडी आधारित चिकित्सा रोगियों की एक बड़ी संख्या के लिए सुलभ बनाने10,11 ,12. इस तरह के विकल्प भी प्रोटीन एक क्रोमैटोग्राफी के नुकसान को दरकिनार कर सकते हैं, कम पीएच पर कठोर elution शर्तों सहित (आमतौर पर;lt;3.5) कि संभावित रूप से conformational परिवर्तन है कि एकत्रीकरण को बढ़ावा देने से गुजरना करने के लिए mAbs पैदा कर सकता है13 . महत्वपूर्ण बात, प्रोटीन ए केवल कुछ आईजीजी उपवर्गों के एफसी क्षेत्र के लिए चयनात्मक है, इसलिए काट दिया बाध्यकारी डोमेन के साथ गैर कार्यात्मक अणुओं को बरकरार उत्पाद5के साथ सह शुद्ध कर सकते हैं, जबकि mAb derivaties जैसे एकल श्रृंखला चर टुकड़े प्रोटीन ए के लिए बिल्कुल भी बाध्य नहीं है।
यहाँ, हम एचआईवी-neutralizing mAb 2F5 अपने रैखिक epitope ELDKWA (एक पत्र एमिनो एसिड कोड)5,14का उपयोग कर कब्जा करने के लिए एक वैकल्पिक संबंध क्रोमैटोग्राफी राल का वर्णन. हम आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन DsRed के सी-टर्मिनस के लिए 2F5 epitope जुड़े, जो एक वाहक और रिपोर्टर अणु के रूप में कार्य किया, और जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन डीsRed-2एफ5-ईpitope (DFE) ट्रांसजेनिक तंबाकू में उत्पादन () निकोटिआना टैबाकम) पौधे। DFE एकल कदम स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) द्वारा शुद्ध किया गया था. शुद्ध DFE आत्मीयता ligand के एक पार से जुड़े agarose राल पर स्थिरीकरण एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) सक्रिय पार से जुड़े agarose कॉलम का उपयोग रासायनिक युग्मन द्वारा प्राप्त किया गया था. सांख्यिकीय प्रायोगिक डिजाइनों का उपयोग तब स्थिरीकरण प्रक्रिया और युग्मन दक्षता15को अनुकूलित करने के लिए किया गया था . mAb 2F5 के लिए शोधन रणनीति एंटीबॉडी शुद्धता, उपज और लिगंड स्थिरता के संदर्भ में मूल्यांकन किया गया था. प्रोटीन ए के विपरीत, जो एफसी क्षेत्र को बांधता है, DFE 2F5 के पूरक-निर्धारण क्षेत्र से बाध्य है, जो एक बरकरार पैराटोप के साथ अणुओं की शुद्धि सुनिश्चित करता है। हमारी अवधारणा को आसानी से किसी भी mAb के लिए अनुकूलित किया जा सकता है एक रैखिक epitope के साथ या अन्य पेप्टाइड आधारित आत्मीयता ligands जो आसानी से microarray अध्ययन16द्वारा पहचाना जा सकता है.
चित्र 1: epitope आत्मीयता रेजिन कि कच्चे संयंत्र के अर्क या सेल संस्कृति supernatants से mAbs के कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तैयारी के लिए प्रक्रिया प्रवाह योजना. (क) ट्रांसजेनिक तम्बाकू पादपों में आत्मीयता लिगन्ड डीएफई व्यक्त की गई थी। काटे गए पत्तों को समरूपित (ग) से पहले एक ऊष्मा वर्षण चरण (बी) शामिल किया गया था . (छ) कच्चे पौधे के अर्क को बैग निस्पंदन, गहराई निस्पंदन और 0.2 डिग्री ग्राम बाँझ निस्पंदन द्वारा स्पष्ट किया गया था। (ई) DFE तो IMAC द्वारा शुद्ध किया गया था. (एफ , जी) शुद्ध DFE आत्मीयता ligand EDC/NHS सक्रिय पार से जुड़े agarose कॉलम पर स्थिर किया गया था. (ज) टी-डीएनए एन्कोडिंग एंटीबॉडी 2F5 को ले जाने वाले जीवाणु संस्कृतियों का उपयोग फाइटोट्रॉन में उगाए गए एन बेंटमैयाना पौधों (मैं) में क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए किया गया था । (जे) एन तुलामैयाना के पत्तों को काटा गया और संसाधित किया गया जैसा कि डी (K) mAb 2F5 में वर्णित किया गया था , डीएफई एफ़िनिटी कॉलम (एल) का उपयोग करते हुए स्पष्ट उद्धरण से शुद्ध किया गया था . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
उपन्यास आत्मीयता राल के आवेदन
हमने दिखाया है कि mAbs के कब्जा करने के लिए कस्टम आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी रेजिन NHS-सक्रिय पार से जुड़े agarose के लिए एक mAb-विशिष्ट एपिटोप युक्त एक ligand immobilizing द्वारा निर्मित किया जा सकता है। इस तरह के एक राल डिजाइन करने के लिए, यह epitope अनुक्रम पता करने के लिए और एक रैखिक epitope का उपयोग करने के लिए आवश्यक था। जिसके परिणामस्वरूप रेजिन mAbs के कब्जा करने के लिए फायदेमंद हैं क्योंकि वे संभावित महंगा प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कदम बदल सकता है. हमारे मामले के अध्ययन में 2F5 और DFE के बीच बातचीत epitope-पैराटोप बाध्यकारी द्वारा मध्यस्थता की गई थी, तो हमारे ligand प्रोटीन ए से अधिक चयनात्मक होना चाहिए, जो सबसे murine और मानव IgGs के एफसी क्षेत्र के लिए बांध. क्योंकि व्यक्तिगत ligands प्रत्येक mAb के लिए आवश्यक हैं, हमारी विधि शुरू में एंटीबॉडी है कि एक बहुत बड़े पैमाने पर उत्पादित कर रहे हैं के लिए मुख्य रूप से उपयुक्त लग सकता है. हालांकि, तेजी से संयंत्र आधारित क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ हमारे दृष्टिकोण के संयोजन के द्वारा, नई आत्मीयता ligands कम से कम 2 सप्ताह27 में कम से कम प्रयास28के साथ तैयार किया जा सकता है. इसलिए, विधि भी छोटे पैमाने पर mAb शुद्धि के लिए उपयुक्त है.
उत्पादन और आत्मीयता के संभावित सुधार ligand
पौधे आत्मीयता के लिए एक तेज और सुरक्षित उत्पादन मंच प्रदानकरतेहैं 5 ,29,30, जैसे कि हमारे मामले के अध्ययन में विशेष रुप से प्रदर्शित डीएफई संलयन प्रोटीन. संयंत्र सामग्री blanching बहुत एक ही कदम में मेजबान सेल प्रोटीन की मात्रा कम है और आसानी से एक मानक स्पष्टीकरण दिनचर्या में एकीकृत किया गया. हालांकि, लिगन्ड की वसूली वर्तमान सेटअप में कम थी, शायद इसकी मध्यम थर्मल स्थिरता और फिल्टर परतों के लिए कुछ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के कारण, जैसा कि अन्य उत्पादों के लिए31,32,33की सूचना दी गई है। इंजीनियरिंग वाहक अपनी थर्मल स्थिरता बढ़ाने के लिए इसलिए भविष्य में लिगेंड उपज में सुधार करने में मदद मिल सकती है, के रूप में मलेरिया टीका उम्मीदवार सीसीटी के लिए वर्णित, antitumor एंजाइम PpADI या एक mesophilic -glucosidase34, 35,36. एक ही गहराई निस्पंदन कदम है, जहां प्रोटीन इंजीनियरिंग फिल्टर सामग्री37के लिए गैर विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने में मदद कर सकते हैं के लिए सच रखती है. डी एफ ई और इसी प्रकार के लिगन्डों की उत्पादन लागत को भी फ्लक्युलेन्ट्स या फिल्टर एडिटिव्स38,39का उपयोग करके स्पष्टीकरण की समग्र दक्षता में सुधार करके कम किया जा सकता है .
जब DsRed एक वाहक के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह एक tetrameric परिसर रूपों. यह फायदेमंद है क्योंकि यह ligand प्रति epitopes की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन यह भी ligand अधिक संबंध क्रोमैटोग्राफी के दौरान disassembly या विकृतीकरण के लिए अतिसंवेदनशील प्रदान कर सकते हैं. एक एकलवाहक वाहक प्रोटीन जैसे कि एम चेरी इसलिए बेहतर हो सकता है , क्योंकि यह कम पीएच40पर स्थिर है , और एपिटोप के अग्रानुक्रम दोहरावों को शामिल करने से लिगन्ड की उत्सुकता में वृद्धि होगी और इस प्रकार राल क्षमता में वृद्धिहोगी 5, 26 , 41.सरल वाहक-एपिटोप प्रोटीन के लिए (यानी, जिनके पास कोई डिसल्फाइड बांड या पोस्ट-अनुवाद संशोधन नहीं है) माइक्रोबियल उत्पादन प्रणालियां विनिर्माण लागतको कम कर सकती हैं और प्रोटीन ए के साथ लिगन्ड्स को अधिक प्रतिस्पर्धी बना सकती हैं। उदाहरण के लिए, जीवाणु कोशिकाओं में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन को 1 ग्राम-1 बायोमास की उपज के साथ व्यक्त किया गया है, जिससे लिगन्ड उत्पादन लागत42में काफी कमी आएगी।
अभिव्यक्ति मेजबान की परवाह किए बिना, एक शुद्ध आत्मीयता ligand युग्मन के दौरान मेजबान सेल प्रोटीन या मीडिया घटक है कि अन्यथा राल चयनात्मकता और क्षमता को कम कर सकते हैं की अचलीकरण को कम करने के लिए आवश्यक था. आईसीए शुद्धीकरण के लिए एक पॉली-हिस्टिडीन टैग को शामिल करने से एक ही चरण में शुद्धता की शुद्धता में 90% की वृद्धि हुई, जिससे तेजी से और सस्ती लिगन्ड उत्पादन5,43,44को सुविधाजनक बनाया गया . हालांकि, संलयन टैग की स्थिति महत्वपूर्ण है क्योंकि यह बाँझ epitope बंधन बाधा या या तो टैग या वाहक से epitope के दरार प्रेरित करने की क्षमता है45,46.
एन एच एस सक्रिय क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर आत्मीयता का अचलीकरण
अचलीकरण मैन्युअल रूप से या एक क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग किया गया था। स्तंभ प्रति छोटे बफर संस्करणों मैनुअल हैंडलिंग के पक्ष में लग रहा था (उदा., न्यूनतम अपशिष्ट मात्रा के कारण). हालांकि, यदि एकाधिक/बड़े स्तंभों की आवश्यकता होती है, तो क्रोमैटोग्राफी सिस्टम युग्मन स्थितियों को नियंत्रित करने में आसान बनाता है (जैसे, विनियमित प्रवाह दर) और इसलिए डीबीसी के संदर्भ में पुन: उत्पादनीय परिणाम प्राप्त करने की अधिक संभावना है। हमारे डेटा का सुझाव है कि युग्मन बफर और पीएच युग्मन दक्षता और समग्र स्तंभ लागत पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. स्क्रीनिंग कारक है कि युग्मन प्रतिक्रिया को प्रभावित करने और उन्हें प्रत्येक वाहक प्रोटीन के लिए समायोजन (या यहां तक कि प्रत्येक वाहक के लिए-लिगेंड संलयन) इसलिए युग्मन दक्षता और राल प्रदर्शन में सुधार सकता है, और हम इस दृष्टिकोण की सिफारिश.
DFE आत्मीयता राल का उपयोग कर 2F5 अलगाव परीक्षण
उत्पाद उपज और शुद्धता राल प्रदर्शन के महत्वपूर्ण पहलू हैं, और Dfe के मामले में हम 105 की उपज हासिल की – 11% (जेडएसडी, n $3) और 97 की शुद्धता – 3% (जेडएसडी, n $3), जो बेंचमार्क प्रोटीन ए रेजिन25 के प्रदर्शन के साथ तुलनीय है ,26. सामान्य में रेजिन के लिए एक और महत्वपूर्ण प्रदर्शन सूचक (और विशेष रूप से आत्मीयता ligands के आधार पर उन लोगों के लिए) 10% उत्पाद सफलता पर डीबीसी है, क्योंकि इस पैरामीटर एक विशिष्ट प्रक्रिया के लिए आवश्यक राल की मात्रा को प्रभावित करता है और इस तरह लागत. DFE ligand के लिए, प्रारंभिक डीबीसी था [4 g] एल-1 राल, जो इसी तरह की परिस्थितियों के तहत प्रोटीन ए के लिए इसी मूल्य का 13% है (केवल 2 मिनट संपर्क समय)25,47 लेकिन के बारे में 15 गुना अधिक अन्य कस्टम आत्मीयता resins की तुलना में इस तरह के रूप में विरोधी FSH-प्रतिरक्षा लिगन्ड 2 मिनट48के एक ही निवास समय का उपयोग कर . डीबीसी के डीबीसी 25 बाँध और elute चक्र के बाद प्रारंभिक मूल्य का 15% करने के लिए गिरावट आई है, जबकि 50 से अधिक चक्र वाणिज्यिक प्रोटीन ए रेजिन49में डीबीसी के एक ही नुकसान के लिए आवश्यक हैं. हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमारे वाहक अभी तक प्रोटीन ए के रूप में एक ही हद तक अनुकूलित नहीं किया गया है, जो व्यापक जांच की गई है और पिछले चार दशकों में सुधार8.
इस प्रकार अब तक हमने निम्न-पीएच एल्यूशन बफर से मैग्नीशियम क्लोराइड की उच्च सांद्रता में परिवर्तन करके राल की स्थिरता और उत्पाद वसूली में सुधार किया है (चित्र 3) जैसा कि पहले के अध्ययन13में सिफारिश की गई थी . आत्मीयता ligand की विशेषता लाल रंग काफी हद तक 25 बाँध और elute चक्र के दौरान फीका नहीं था, तो हम सोचते हैं कि स्पष्ट संयंत्र निष्कर्षों में अंतर्जात संयंत्र proteases31 छोटा हो सकता है और इस तरह के epitope निष्क्रिय लिगन्ड. इसलिए, वाहक और एपिटोप से कनेक्ट करने के लिए प्रोटीज़-प्रतिरोधी लिंकर डिजाइन करने से प्रारंभिक डीबीसी को चक्रों की एक विस्तारित संख्या से अधिक बनाए रखने में मदद मिल सकती है। तेजी से और सरल अभिव्यक्ति और DFE ligand की शुद्धि को देखते हुए, वाणिज्यिक क्रोमैटोग्राफी रेजिन के लिए अपनी सीधी युग्मन, और इसके उत्कृष्ट उत्पाद उपज और शुद्धता, हम मानते हैं कि हमारी विधि प्रोटीन के लिए एक उपयुक्त विकल्प प्रदान करता है एक के लिए mAbs और एंटीबॉडी डेरिवेटिव जो प्रोटीन ए के लिए बाध्य नहीं है की शुद्धि, खासकर अगर वाहक और linker में सुधार डीबीसी और लिगेंड स्थिरता में सुधार कर सकते हैं. इस धारणा DFE-शुद्ध और प्रोटीन ए-शुद्ध 2F5 एंटीबॉडी5के वियोजन स्थिरांक में छोटे अंतर द्वारा समर्थित था, यह दर्शाता है कि हमारे नए संबंध ligand उच्च गुणवत्ता mAbs की वसूली की अनुमति देता है.
लाभ और विधि की वर्तमान सीमाएं
एक वाहक प्रोटीन के साथ एक आनुवंशिक संलयन के रूप में आत्मीयता ligand उत्पादन जलीय बफ़र्स में घुलनशीलता बढ़ जाती है और इस प्रकार ठेठ लिगन्ड युग्मन स्थितियों के साथ संगतता. इसके विपरीत, ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण से व्युत्पन्न रिक्त पेप्टाइड्स उनके अनुक्रम के कारण इन शर्तों के तहत घुलनशीलता सीमित हो सकता है50, जो परिवर्तित नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह mAb द्वारा मान्यता प्राप्त एपिटोप के एमिनो एसिड अनुक्रम द्वारा निर्धारित है शुद्ध किया जा सकता है. दूसरों इसलिए पेप्टाइड ligands51के एक पर राइस संश्लेषण का इस्तेमाल किया है. जिसके परिणामस्वरूप राल की स्थैतिक बंधन क्षमता अधिक थी ($80 g] एल-1),लेकिन राल तैयारी की प्रक्रिया लंबी है, एक गतिशील बाध्यकारी क्षमता की सूचना नहीं थी और प्राप्त शुद्धता और वसूली हमारे दृष्टिकोण की तुलना में कम थे. प्रयोगशाला पैमाने पर एक संलयन प्रोटीन लिगन्ड का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि लिगन्ड और वेरिएंट तेजी से उत्पादन किया जा सकता है, शुद्ध और एक आसान करने के लिए उपयोग उच्च के माध्यम से अभिव्यक्ति प्रणाली52में कम से कम प्रयास के साथ परीक्षण किया.
यहाँ प्रस्तुत विधि की दो वर्तमान सीमाएँ 3 g की कम गतिशील बाइंडिंग क्षमता हैं। एल-1 और इसके 90% 25 बाँध और elute चक्र5के पाठ्यक्रम पर कमी . इन सीमाओं को भविष्य में कम कड़े लोडिंग शर्तों को लागू करने और क्रमशः एक इंजीनियर, अधिक स्थिर संस्करण के साथ वर्तमान DsRed वाहक की जगह से संबोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, वर्तमान संपर्क समय को 2 से 4 मिनट तक दोगुना करने में गतिशील बाइंडिंग क्षमता को दोगुना करने की क्षमता होती है जैसा कि कुछ प्रोटीन ए रेजिन26के लिए दिखाया गया था।
समस्या निवारण
निम्न तालिका उन संभावित समस्याओं पर प्रकाश डालती है जिनका सामना इस प्रोटोकॉल के दौरान किया जा सकता है और उन्हें हल करने के तरीके पर संकेत प्रदान करता है (तालिका 1)।
तालिका 1: संभावित समस्याओं का सामना किया जा सकता है और संभावित फिक्सेस। | |||
प्रोटोकॉल चरण | समस्या | Couse | ठीक करना |
1 | पौधे नहीं उगाते | समझौता विकास की स्थिति | पीएच और उर्वरक की चालकता की जाँच करें |
तापमान और प्रकाश की स्थिति की जाँच करें | |||
2 और 3 | निकासी के बाद मेजबान सेल प्रोटीन की बड़ी मात्रा में मौजूद हैं | अपूर्ण वर्षण | ब्लैंचिंग के दौरान तापमान की जांच करें |
ब्लैंचिंग स्नान में आंदोलन की जाँच करें | |||
2 और 3 | संयंत्र निकालने में कोई उत्पाद नहीं मिला | ब्लैंचिंग तापमान बहुत अधिक | ब्लैंचिंग के दौरान तापमान और पीएच की जांच करें |
ब्लैंचिंग बफर में पीएच बहुत कम | |||
3 | बड़े स्टेम या पत्ती भागों निष्कर्षण के बाद रहते हैं | ब्लेंडर में अधूरा मिश्रण | सुनिश्चित करें कि संयंत्र सामग्री ब्लेंडर में एक प्लग फार्म नहीं करता है |
3 | गहराई निस्पंदन के दौरान तेजी से दबाव में वृद्धि | गलत फ़िल्टर चयन और/ | फ़िल्टर प्रकार और ओरिएंटेशन की जाँच करें |
4 | elution के दौरान थोड़ा संलयन प्रोटीन / प्रवाह के माध्यम से संलयन प्रोटीन का एक बहुत | IMAC राल धातु आयनों के साथ आरोप नहीं लगाया गया था | जाँच करें कि IMAC राल सही आयनों के साथ चार्ज किया गया था |
फ्यूजन प्रोटीन आत्मीयता टैग खो दिया है | पौधे की खेती के दौरान तीव्र धूप और उच्च तापमान से बचें | ||
4 | एकाग्रता के दौरान खोया फ्यूजन प्रोटीन | फ्यूजन प्रोटीन झिल्ली के लिए बाध्य | झिल्ली प्रकार की जाँच करें |
सुनिश्चित करें कि एकाग्रता कारक बहुत अधिक नहीं था | |||
5 | कम युग्मन उपज | युग्मन अभिकर्मक योग का गलत अनुक्रम | अभिकर्मकों लेबल और इसके अलावा के अनुक्रम की जाँच करें |
युग्मन से पहले स्तंभों की गलत तैयारी | स्तंभ पूर्वपरासन की शर्तों की जाँच करें | ||
5 और 6 | कम mAb उपज | संयंत्र बायोमास में कम mAb अभिव्यक्ति | बायोमास में परीक्षण mAb अभिव्यक्ति |
कम लिगन्ड घनत्व | संलयन प्रोटीन तैयारी की शुद्धता की जाँच करें | ||
7 | ब्रैडफोर्ड परख में बहुत कम / | पाइपिंग के दौरान बुलबुला गठन | 96-वेल पाल्टे में बुलबुले के लिए जाँच करें |
7 | एसपीआर माप के दौरान कम mAb एकाग्रता | समझौता प्रोटीन एक चिप | ज्ञात एकाग्रता के साथ मानक mAb के परिणामों के साथ तुलना करें |
गलत नमूना तनुकरण | कमजोर पड़ने की दर और बफर की जाँच करें |
तालिका 1: मुसीबत-शूटिंग.
The authors have nothing to disclose.
हम ट्रांसजेनिक तंबाकू पौधों की खेती के लिए इब्राहिम अल Amedi और डॉ थॉमस Rademacher तंबाकू अभिव्यक्ति वेक्टर प्रदान करने के लिए स्वीकार करना चाहते हैं. लेखकों को संपादकीय सहायता और Markus Sack DFE आत्मीयता ligand संरचना के बारे में उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ रिचर्ड एम Twyman धन्यवाद देना चाहता हूँ. इस काम के हिस्से में अनुदान नहीं के तहत Fraunhofer-Gesellschaft आंतरिक कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था. 125-600164 को आकर्षित और Leistungszentrum अनुदान संख्या 423 “नेटवर्क, अनुकूली उत्पादन” के तहत उत्तर-रिन-वेस्टफेलिया की स्थिति। इस काम को अनुसंधान प्रशिक्षण समूह “ट्यूमर-लक्षित ड्रग डिलिवरी” अनुदान 331065168 के ढांचे में ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित किया गया था। जीई स्वास्थ्य सेवा इस लेख के खुले उपयोग प्रकाशन का समर्थन किया.
10L/20L Bucket | n/a | n/a | Blanching equipment |
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
ÄKTApure | GE Helthcare | 29018226 | Chromatography system |
Allegra 25R | Beckman Coulter | 369434 | Centrifuge |
Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
Antibody 2G12 | Fraunhofer IME | n/a | Standard for SPR quantification |
Blender | Waring | 800EG | Blender |
BP-410 | Fuhr | 2632410001 | Bag filter |
CanoScan 5600F | Canon | 2925B009 | Scanner |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
Chelating Sepharose FF | GE Helthcare | 17-0575-01 | Chromatography resin |
Cond 3320 | WTW | EKA 3338 | Conductometer |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n/a | DoE software |
Discovery Compfort | Gilson | F81029 | Multichannel pipette |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Diverse bottles | Schott Duran | n/a | Glas bottles |
Dri Block DB8 | Techne | Z381373 | Heat block |
DsRed | Fraunhofe IME | n/a | Standart |
EDTA | Carl Roth GmbH | 8043.2 | Buffer component |
EnSpire | Perkin Elmer | 2390-0000 | Plate reader |
ETHG-912 | Oregon Scientific | 086L001499-230 | Thermometer |
F9-C | GE Helthcare | 29027743 | Fraction collector |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Buffer component |
Hettich Centrifuge Mikro 200 | Hettich | 2400 | Centrifuge |
HiPrep 26/10 | GE Helthcare | GE17-5087-01 | Chromtography column |
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL | GE Helthcare | 17-0716-01 | Chromatography columns |
Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH | 4625.1 | Buffer component |
Imidazole | Carl Roth GmbH | 3899.2 | Buffer component |
K700 | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
KM02 basic | IKA | n/a | Magnetic stirrer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Immersion circulator |
Magnesium chloride | Carl Roth GmbH | KK36.2 | Buffer component |
Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
Minisart 0.2 µm | Sartorius | 16534K | Filter unit |
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter | Thermo Fischer Scientific | 595-4520 | Vacuum filtration of SPR buffers |
Nickel sulphate | Carl Roth GmbH | T111.1 | Buffer component |
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels | Invitrogen | NP0336BOX | LDS-PAA gels |
Novex X-cell Mini Cell | Invitrogen | EI0001 | PAGE chamber |
NuPAGE 20x running buffer | Invitrogen | NP0002 | Buffer concentrate |
NuPAGE antioxidant | Invitrogen | NP0005 | Antioxidant |
PageRuler protein ladder (10-180 kDa) | Invitrogen | 26616 | Protein standart |
Perforated bucked | n/a | n/a | Blanching |
PH 3110 | WTW | 2AA110 | PH meter |
PowerPac HC | Biorad | 1645052 | Electrophoresis module |
Protein A from Staphylococcus aureus | Sigma-Aldrich | P7837-5MG | Coating of SPR chips |
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran | GE Helthcare | 17003301 | Chromatography resin |
Silicone spoon | n/a | n/a | Spoon |
Simply Blue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Gel staining solution |
Sodium acetate | Carl Roth GmbH | 6773.1 | Buffer component |
Sodium acetate | Carl Roth GmbH | X891.1 | Media component |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-100G | Media component |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Buffer component |
Sodium citrate | Carl Roth GmbH | HN13.2 | Buffer component |
Sodium bisulfite | Carl Roth GmbH | 243973-100G | Media component |
Sodium phosophate | Carl Roth GmbH | T877.2 | Media component |
SPR Affinity Sensor – High Capacity Amine | Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics | SPR-AS-HCA | SPR chip |
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer | Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics | n/a | SPR device |
SSM3 | Stuart | 10034264 | Mini Gyro-rocker |
Heated vessel, 20 L | Clatronic | n/a | Blanching chamber |
Sterile syringes, 2 mL | B. Braun | 4606027V | Syringes |
Syringe adpter (Union Luer F) | GE Helthcare | 181112-51 | Syringe adapter |
TE6101 | Sartorius | TE6101 | Precision scale |
Tween-20 (Polysorbate) | Merck | 8170721000 | Buffer component |
Unicorn 6.4 | GE Helthcare | 29056102 | Chromatography software |
Vacuum bags | Ikea | 203.392.84 | Plant storge |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
XK-26/20 column housing | GE Helthcare | 28-9889-48 | Chromtography column |