إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي
Summary
تقدم هذه المقالة أساليب إعداد العينة لطريقة تحليلية فريدة في الوقت الحقيقي استنادًا إلى قياس الطيف الكتلي المحيط. هذه الطريقة تتيح لنا إجراء تحليل في الوقت الحقيقي للجزيئات البيولوجية في الجسم الحي دون أي علاجات مسبقة خاصة.
Abstract
قياس الطيف الكتلي (MS) هو أداة قوية في الكيمياء التحليلية لأنه يوفر معلومات دقيقة للغاية حول الجزيئات ، مثل نسب الكتلة إلى الشحن(m /z)، والتي هي مفيدة لاستقراء الأوزان والهياكل الجزيئية. في حين أنه هو في الأساس طريقة تحليلية مدمرة ، فإن التطورات الأخيرة في تقنية التأين المحيطمكنتنا من الحصول على البيانات مع ترك الأنسجة في حالة سليمة نسبيًا من حيث النزاهة. تأين الرذاذ الكهربائي (PESI) هو ما يسمى طريقة مباشرة لأنها لا تتطلب معالجة معقدة وتستغرق وقتا طويلا من العينات. إبرة غرامة بمثابة منتقي العينة، فضلا عن باعث التأيين. استنادا إلى خاصية حادة جدا وغرامة من تلميح التحقيق، وتدمير العينات هو الحد الأدنى، مما يسمح لنا للحصول على المعلومات الجزيئية في الوقت الحقيقي من الكائنات الحية في الموقع. هنا ، نقدم ثلاثة تطبيقات لتقنية PESI-MS التي ستكون مفيدة للبحث والتطوير في مجال الطب الحيوي. واحد ينطوي على تطبيق على الأنسجة الصلبة، وهو التطبيق الأساسي لهذه التقنية للتشخيص الطبي. وبما أن هذه التقنية تتطلب 10 ملغ فقط من العينة ، فقد تكون مفيدة للغاية في الإعدادات السريرية الروتينية. التطبيق الثاني هو للتشخيص الطبي في المختبر حيث يتم قياس مصل الدم البشري. كما أن القدرة على قياس عينات السوائل قيِّمة في مختلف التجارب البيولوجية حيث لا يمكن توفير كمية كافية من العينات للتقنيات التحليلية التقليدية. التطبيق الثالث يميل نحو التطبيق المباشر للإبر التحقيق في الحيوانات الحية، حيث يمكننا الحصول على ديناميات في الوقت الحقيقي من الأيض أو المخدرات في أجهزة محددة. في كل تطبيق، يمكننا استنتاج الجزيئات التي تم اكتشافها من قبل مرض التصلب العصبي المتعدد أو استخدام الذكاء الاصطناعي للحصول على تشخيص طبي.
Introduction
قياس الطيف الكتلي (MS) هو تحقيق تكنولوجي للنزعة الاختزالية؛ أنه يقلل من موضوع التحليل إلى وحدة التي يمكن تفسيرها على أساس الأنواع الجزيئية أو الشلالات. ولذلك، هو أسلوب تمثيلي للكيمياء التحليلية. وهي تتكون من أربع عمليات: التأين والتحليل والكشف والاستحواذ الطيفي. لأن تأين الجزيء هو أول عملية في قياس الطيف الكتلي ، فإنه يقيد بشكل عام شكل التحاليل التي سيتم معالجتها. تتطلب معظم إجراءات التأيّن تدمير بنية العينات العضوية ومورفولوجياها وعملياتها البيولوجية في الوقت الحقيقي. على سبيل المثال، يتطلب التأيين الكهربائي (ESI) MS أن تكون العينات في حالة سائلة للتأيين الفعال1. العينات ، لذلك ، يجب أن تذهب من خلال إعداد البيوكيميائية المعقدة ، والتي تغير تكوين الجزيئات. بدلا من ذلك ، في حين أن المزازة الليزر بمساعدة مصفوفة (MALDI) MS يمكن إعادة بناء الخرائط الجزيئية للأنسجة المقطعة رقيقة2،3، كفاءتها التأين منخفضة جدا للكشف عن جميع الجزيئات في العينات ، وأنها سيئة بشكل خاص في تحليل الأحماض الدهنية. وبالنظر إلى هذه القيود، يمكن استخدام تأين الرذاذ الكهربائي (PESI)4 لرصد التغيرات في الوقت الحقيقي في النظم البيولوجية في الموقع دون تدمير السلامة الهيكلية5، في حين أن الكائن البيولوجي الذي يتم ملاحظته هو من الناحية الفنية في حالة حية. يتم استخدام إبرة دقيقة جدا في هذه الحالة التي تعمل في وقت واحد كما منتقي العينة وباعث أيون. وهذا يعني أنه يمكن تجاوز تسلسلات المعالجة المسبقة للعينة المعقدة للحصول على أطياف كتلة تعكس المكونات الجزيئية للنظام الحي في الموقع.
هناك العديد من أساليب التأين الأخرى التي تنافس PESI-MS. واحد هو قياس الطيف التأين يتبخر السريع (REIMS)6. تعمل هذه التقنية بشكل جيد أثناء الجراحة لأنه يتم تجميعها بسكين كهربائي وتجمع عمود الأيون المتولد أثناء الشق. في حين REIMS مفيد جدا لعملية جراحية، بل هو في الأساس طريقة مدمرة تتطلب الاستئصال الكهربائي للأنسجة. لذلك ، فإنه ليس من المفيد للتحليل التفصيلي للخلايا والأنسجة في عينة إعدادية أو في التحليلات المختبرية. وعلاوة على ذلك ، لأنه يجمع كمية كبيرة من عمود تحتوي على حطام الأنسجة ، فإنه يتطلب صيانة طويلة للأجهزة بعد كل استخدام ، وبالتالي الحد من استخدام هذا الجهاز إلى الإجراءات الجراحية الخاصة. وهناك طريقة مماثلة، تسمى قياس الطيف الكتلي الأياني بالليزر (LDI-MS)7، هي تقنية أخرى غير باضعة ومفيدة لتحليل السطح. لأن هذه التقنية جيدة في مسح سطح العينة ، فإنه يحقق تحليل شامل ثنائي الأبعاد مثل قياس الطيف الكتلي التصوير MALDI8،9. ومع ذلك، نظرًا لأن LDI-MS ينطبق فقط على التحليل السطحي، فإن PESI-MS مفيد لتحليل العينات على سبيل المثال، داخل الأنسجة. وثمة تقنية أخرى، هي MasSpec Pen10،أفيد بأنها تحقق خصوصية وحساسية عالية في تشخيص سرطان الغدة الدرقية، ولكن قطر المسبار هو في ترتيب ملم وهو محدد لتحليل السطح، مما يعني أنه لا يمكن الكشف عن عقيدات صغيرة من السرطان أو الآفات المترجمة بعمق. وعلاوة على ذلك، وبما أن هذه الطريقة تستخدم قناة تدفق ميكروالخمسينيبيلية مضمنة في قلم المسبار، يجب أن يؤخذ التلوث المتبادل في الاعتبار، على غرار LDI-MS. توجد تقنيات أخرى تم تطبيقها على الإعدادات السريرية ، مثل مسبار التدفق والمسحة نموذج التأين11، ولكنها ليست واسعة الانتشار.
PESI هو تصغير المدقع من ESI، حيث الشعيرات الدموية من النانو-electrospray يتلاقى على إبرة صلبة مع نصف قطرها انحناء تلميح من عدة مئات نانومتر. التأين يحدث في منطقة مقيدة للغاية من طرف إبرة عن طريق تشكيل مخروط تايلور، والتي تبقى عينات حتى تأين جميع السوائل على طرف اكتمال12. إذا بقي المناقّل على طرف الإبرة المعدنية، يتم توليد الشحن الزائد باستمرار في الواجهة بين الإبرة المعدنية وanalytes. لذلك ، يحدث تأيين الجزيئات بشكل متسلسل اعتمادًا على نشاطها السطحي. هذه الخاصية يجعل طرف إبرة نوع من الكروماتوغرام، وفصل المناقبين اعتمادا على نشاطها السطحي. أكثر من الناحية الفنية ، والجزيئات مع النشاط سطح أقوى تأتي إلى سطح مخروط تايلور وتأين في وقت سابق من تلك التي مع ضعف النشاط السطحي ، والتي تلتصق سطح الإبرة حتى نهاية عملية التأين. وهكذا ، يتم تحقيق تأين كامل لجميع الجزيئات التي التقطتها الإبرة13. وعلاوة على ذلك، لأن هذه التقنية لا تنطوي على إضافة المذيبات زائدة عن الحاجة إلى العينة، عدة مئات من femtoliters كافية للحصول على أطياف كتلة قوية بما يكفي لمزيد من التحليل14. هذه الخصائص مفيدة لتحليل العينات البيولوجية سليمة. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي لـ PESI-MS يكمن في انقطاع التأيين بسبب حركة التردي للإبرة على طول المحور الرأسي ، على غرار آلة المنشار. التأين يحدث فقط عندما يصل طرف المسبار إلى أعلى نقطة عندما يكون ارتفاع فتحة الأيون محاذياً على المحور الأفقي. التأين يتوقف في حين أن الإبرة تلتقط العينات، وبالتالي فإن استقرار التأين لا يساوي ذلك في ESI التقليدية. لذلك، PESI-MS ليست طريقة مثالية للبروتيوميات.
وحتى الآن، طُبق نظام PESI-MS بشكل رئيسي على تحليل النظم البيولوجية، التي تغطي مجموعة واسعة من المجالات من البحوث الأساسية إلى البيئات السريرية. على سبيل المثال ، كان التحليل المباشر للأنسجة البشرية التي أعدت أثناء الجراحة قادرًا على الكشف عن تراكم ثلاثي الخلايا الثلاثية في كل من سرطان الخلايا الكلوية15 وسرطان الحركوما البلعفي16. يمكن لهذه الطريقة أيضًا قياس العينات السائلة، مثل الدم، للتركيز على الملف الشخصي للدهون. فعلى سبيل المثال، تم تحديد بعض الجزيئات أثناء التغيرات الغذائية في الأرانب؛ وأفيد أن بعض هذه الجزيئات انخفضت في المراحل المبكرة جدا من التجارب، مما يدل على حساسية عالية وفائدة هذا النظام للتشخيص السريري17. وعلاوة على ذلك، تطبيق مباشر لالحيوان الحي سمح الكشف عن التغيرات الكيميائية الحيوية للكبد بعد ليلة واحدة فقط من الصيام5. زار Zaitsu وآخرون18 هذه التجربة5 وتحليل ملامح التمثيل الغذائي للكبد بنفس الطريقة تقريبا، مع النتائج التي عززت الاستقرار واستنساخ طريقتنا الأصلية. وعلاوة على ذلك، تمكنا من التمييز بين الأنسجة السرطانية من الكبد غير السرطاني المحيط ة في الفئران باستخدام هذه التقنية19. لذلك ، هذا هو تقنية قياس الطيف الكتلي متعددة الاستخدامات المفيدة في إعدادات مختلفة ، سواء في الجسم الحي أو في المختبر. من وجهة نظر أخرى ، يمكن إجراء وحدة PESI لتناسب مطياف الكتلة المختلفة عن طريق ضبط المرفق المتصاعد. في هذه المقالة القصيرة ، نقدم أساسيات وأمثلة التطبيقات(الشكل 1)، بما في ذلك التطبيقات مع الحيوانات الحية5.
ووفقا ً للأنظمة والقوانين في كل بلد، سيلزم تنقيح أجزاء من هذا البروتوكول للوفاء بمعايير كل مؤسسة. تطبيق على الكائن الحي هو الأكثر إثارة للاهتمام والتحدي لأنه يمكن أن توفر التغيرات الكيميائية الحيوية أو الأيضية في الأنسجة أو الأعضاء في الحيوانات الحية في الموقع. في حين تمت الموافقة على هذا الطلب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات في جامعة ياماناشي، في عام 20135،جولة أخرى من الموافقة سيكون من الضروري الآن بسبب التغييرات الأخيرة في اللوائح للتجارب الحيوانية. ولذلك، من المستصوب إدخال عدة تعديلات على المخطط التجريبي. وفيما يتعلق بالأطياف الجماهيرية التي تم الحصول عليها في التجارب، مع أخذ تقلبات الأطياف الجماهيرية بين كل قياس في الاعتبار، لا يوجد نظام طيفي لتبادل المعلومات مشترك بين مجتمع تسلسل النيوكليوتيدات. يجب توخي الحذر عندما يتعامل المشغل مع الإبرة لتجنب حوادث إبرة عصا, خاصة عند إزالة الإبرة من حامل إبرة. جهاز خاص لفصل الإبرة مفيد جدا لهذا الغرض. وبما أن مقصورة وحدة PESI هي غرفة مغلقة محكمة الإغلاق ، فإن تسرب عمود الأيون لا يحدث إذا تم تشغيل مطياف الكتلة وفقًا للتعليمات.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن PESI هو مشتق من ESI لقياس الطيف الكتلي4، فمن الأكثر فائدة لرصد metabolomics في الوقت الحقيقي ، وكذلك لتحليل التفاعلات الكيميائية الحيوية دون إجراء أي علاجات مسبقة معقدة أو تستغرق وقتًاطويلا5،14،15،17. و…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أيومي إيزوكا لتشغيلها PESI-MS وكازوكو سوا-نوبوري على مساعدتها في مجال السكرتارية. نشكر برونوين غاردنر، دكتوراه، من مجموعة إدانز (www.edanzediting.com/ac) لتحريرمسودة هذه المخطوطة.
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
Riferimenti
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology – Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
