DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用
Summary
このプロトコルは、DNA損傷を評価するために彗星アッセイで使用するための壊死時に高品質の凍結組織サンプルを調製するためのいくつかの手順を説明します:1)細かい組織、2)消化管からの掻き取られた上皮細胞、および3)立方体組織サンプルは、組織ミンチ装置を用いて均質化を必要とする。
Abstract
この彗星アッセイは、培養細胞や組織、特に化学物質やその他の環境ストストレス剤への暴露後のDNA損傷を評価する手段として人気を集めています。げっ歯類の遺伝子毒性ポテンシャルに対する規制試験における彗星アッセイの使用は、2014年に経済協力開発機構(OECD)の試験ガイドラインの採択によって推進されている。彗星アッセイスライドは、典型的には、壊死時に新鮮な組織から調製される。しかし、凍結組織サンプルは、動物1匹当たりおよび研究ごとに多くの動物からの複数の臓器からのスライドの同時調製に関連する物流上の課題を回避することができます。凍結はまた分析のために暴露施設から別の実験室にサンプルを出荷することを可能にし、凍結組織の貯蔵は、特定の器官のDNA損傷データを生成する決定を延期することを容易にする。アルカリ性彗星アッセイは、露光関連DNAの二重および一本鎖の破断、アルカリ性不安定性病変、不完全なDNA切除修復に関連する鎖破断を検出するのに有用である。しかし、DNA損傷は、機械的なせん断または不適切なサンプル処理手順からも生じ、アッセイの結果を混乱させる可能性があります。壊死時の組織サンプルの収集と処理における再現性は、彗星アッセイのための組織の収穫の経験の様々なレベルを持つ実験室の人員の変動のために制御することが困難である可能性があります。経験豊富なラボスタッフを配置したリフレッシュトレーニングやモバイルユニットの展開を通じて一貫性を高めるにはコストがかかり、必ずしも実現可能とは限りません。彗星アッセイ分析用の高品質サンプルの生成を一貫して最適化するために、カスタマイズされた組織ミンチ装置を用いて組織の凍結された立方体のフラッシュを均質化する方法を評価した。この方法によって彗星アッセイのために調製されたサンプルは、壊死中にミンチすることによって調製された新鮮で凍結した組織サンプルと品質において良好に比較した。さらに、長期保存後の組織の凍結キューブからの細胞における低ベースラインDNA損傷を測定した。
Introduction
この彗星アッセイは、化学物質や他の環境ストルッサー1にさらされた培養細胞および組織におけるDNA損傷を評価する手段としてますます使用されている。このアッセイは、不完全なDNA修復に関連するDNA二重および一本鎖の破断、アルカリ陰茎病変、および一本鎖の破断を検出することができる。医薬品検査のための医薬品技術要件の国際協議会(ICH)ガイドラインは、生体内の遺伝毒性を評価するためのげっ歯類赤血球微小核アッセイを補完し、腫瘍誘導の標的臓器における作用様式を評価するためのフォローアップテストとして、彗星アッセイなどのDNA鎖破損アッセイを推奨しています。欧州食品安全機関(EFSA)は、生体内彗星アッセイを、体外遺伝毒性試験3における陽性結果の関連性を調査するための適切なフォローアップ試験として推奨している。2014年、OECD試験ガイドラインがげっ歯類彗星アッセイに承認され、遺伝子毒性ポテンシャルの規制試験に使用するアッセイの受容性が高められた。このアッセイは、リラックスしたDNAループと、リセド細胞のヌクレオイドから移行する断片の電気泳動分離に基づいています。基本的に、単一の細胞は、顕微鏡スライドに重ねられたアガロースに埋め込まれています。スライドは溶解バッファーに浸漬され、その後にアルカリ性(pH > 13)溶液が続き、しっかりとコイル状の核DNAがリラックスしてくつろぐことができます。その後、スライドを電界に配置し、負に帯電したDNAを負の電荷から陽極に向かって移動させ、彗星に似た画像を作成します。彗星の頭部と比較して彗星の尾のDNAの相対的な量はDNA損傷の量に直接比例する;尾部のDNA含有量は、典型的には、デジタルイメージングソフトウェアを用いて定量される。
彗星アッセイは断片化したDNAを検出するため、治療による細胞毒性またはストレスに起因する壊死またはアポトーシスに関連するクロマチン断片化によって、暴露誘発DNA損傷の正確な定量化が可能です。さらに、機械的なせん断または不適切なサンプル処理4の結果としてDNA損傷が起こり得る。DNA損傷のベースラインレベルを最小限に抑えるためにスライド調製の前に、収穫された組織を冷やして維持することの重要性は、前に5,6,6に実証されている。多くの研究所は、新鮮なティッシュから彗星アッセイスライドを準備します。しかし、これは、多数の動物を含む研究で動物ごとに複数の組織タイプからのスライドを準備する場合、ロジスティックに困難な場合があります。さらに、これは、スライドの準備と分析がリモートの実験室で発生する場合に問題を提示し、サンプルの出荷を必要とします。例えば、米国の国家毒物学プログラムは、その遺伝子毒物学試験プログラム(https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html)の構成要素として彗星アッセイを含み、時には28日または90日の反復用量毒性試験にアッセイを組み込む。これは、インライフラボによる組織の収集と分析のために別の実験室へのサンプルの転送を必要とします。これを達成するために、組織片が細かく切断され、および/または胃腸管の上皮細胞が掻き取られ、細胞懸濁液が凍結し、その後の出荷および記憶のために冷凍庫に保管され、その後の検査室による分析7まで保存される。サンプルの適切な取り扱いは、凍結組織を使用して高品質のデータを取得するために重要です。しかし、絶えず変化する人員によって行われる壊死時の組織サンプルの再現性操作は、特に彗星アッセイのために日常的に組織を収穫しないインライフラボでは制御が困難である。壊死のスタッフのリフレッシュトレーニングや、経験豊富な研究室のスタッフが新鮮または凍結した組織サンプルを収集するためのモバイルユニットの使用は、多くの場合、あまりにも高価で、実現不可能であるか、単に過小評価されています。
彗星アッセイ分析のために遠隔部位に移送するための高品質の組織サンプルの一貫した生成をより良くするために、組織のフラッシュ凍結キューブからの組織保存の公表された方法6の有用性が検討された。この方法では、凍結した組織の立方体をステンレス鋼組織ミンチ装置(図1)に装填し、冷たい緩衝液を含むマイクロ遠心管に入れる。組織の立方体は、デバイスの端にある小さなゲージメッシュを通して押されます。メッシュのふるいを介して繰り返し組織懸濁液を両側向きに押し付けると、比較的均一な単一細胞懸濁液が生じる。この方法で調製されたサンプルは、ミンチによって調製された新鮮な組織および凍結した組織サンプルと品質において良好に比較した。追加の利点として、ひきびサンプルとは異なり、組織キューブは長期間凍結保存することができ、まだ彗星アッセイで高品質の結果をもたらす。
Protocol
Representative Results
Discussion
前に示したように7、7、12、13、12,13適切に取り扱うフラッシュ凍結ひき肉組織は、彗星アッセイにおいて良好な結果を提供する。実際、私たちの研究室で調製された凍結したひき肉およびマウス肝臓のベースライン%テールDNA値は、典型的には、新たにひき刻まれたラット肝臓サンプルに対するOECD試験ガイドライン<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、リンカーン・マーティンとケリー・オーエンズに対し、彗星スライドの準備と採点に関する専門的な技術支援と、統計分析を行うためのキャロル・スワルツ博士に恩恵を受けている。著者らはまた、ILSの遺伝的毒物学、調査毒物学、および壊死プログラムのメンバーの支持的な貢献を認めている。
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
Riferimenti
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