Bruk av frosset vev i kometanalysen for evaluering av DNA-skade
Summary
Denne protokollen beskriver flere prosedyrer for å forberede frosne vevsprøver av høy kvalitet på tidspunktet for necropsy for bruk i kometanalysen for å vurdere DNA-skade: 1) hakket vev, 2) skrapte epitelceller fra mage-tarmkanalen, og 3) cubed vev prøver, som krever homogenisering ved hjelp av en vevshakkingsenhet.
Abstract
Kometanalysen blir stadig mer populært som et middel til å vurdere DNA-skade i kultiverte celler og vev, spesielt etter eksponering for kjemikalier eller andre miljøstressfaktorer. Bruk av kometanalysen i regulatorisk testing for gentoksisk potensial hos gnagere har blitt drevet av vedtakelsen av en testlinje for organisasjon for økonomisk samarbeid og utvikling (OECD) i 2014. Kometanalyselysbilder er vanligvis tilberedt av friskt vev på tidspunktet for necropsy; Frysing av vevsprøver kan imidlertid unngå logistiske utfordringer forbundet med samtidig fremstilling av lysbilder fra flere organer per dyr og fra mange dyr per studie. Frysing gjør det også mulig å sende prøver fra eksponeringsanlegget til et annet laboratorium for analyse, og lagring av frosset vev forenkler å utsette en beslutning om å generere DNA-skadedata for et gitt organ. Alkaliinkometanalysen er nyttig for å oppdage eksponeringsrelaterte DNA-dobbelt- og enkelttrådpauser, alkali-labile lesjoner og strandbrudd forbundet med ufullstendig DNA-eksisjonsreparasjon. DNA-skader kan imidlertid også skyldes mekanisk klipping eller feil prøvebehandlingsprosedyrer, noe som forvirrer resultatene av analysen. Reproduserbarhet i innsamling og behandling av vevsprøver under necropsies kan være vanskelig å kontrollere på grunn av varierende laboratoriepersonell med varierende nivåer av erfaring i høsting av vev for kometanalysen. Å forbedre konsistensen gjennom oppfriskningsopplæring eller distribusjon av mobile enheter bemannet med erfarne laboratoriepersonell er kostbart og kan ikke alltid være mulig. For å optimalisere konsekvent generering av prøver av høy kvalitet for analyse av kometanalyse, ble en metode for homogenisering av blitsfrosne kuber av vev ved hjelp av en tilpasset vevssertifiseringsenhet evaluert. Prøver utarbeidet for kometanalysen ved denne metoden sammenlignet gunstig i kvalitet til friske og frosne vevsprøver tilberedt ved å hakke under necropsy. Videre ble lav baseline DNA skade målt i celler fra frosne terninger av vev etter langvarig lagring.
Introduction
Kometanalysen brukes i økende grad som et middel til å evaluere DNA-skade i kultiverte celler og vev utsatt for kjemikalier eller andre miljøstressfaktorer1. Analysen kan oppdage DNA dobbel- og enkelt-strand pauser, alkali-labile lesjoner, og single-strand pauser forbundet med ufullstendig DNA reparasjon. Det internasjonale rådet for harmonisering av tekniske krav til legemidler for human bruk (ICH) retningslinje for farmasøytisk testing anbefaler en DNA strand brudd analyse som kometanalysen som en andre test for å supplere gnagererytrocytt mikronukleusanalyse for vurdering in vivo genotoxicity og som en oppfølgingstest for å vurdere handlingsmåte i målorganer av tumorinduksjon2. Det europeiske mattilsynet (EFSA) anbefaler in vivo kometanalysen som en passende oppfølgingstest for å undersøke relevansen av et positivt resultat i en in vitro gentoksisitetstest3. I 2014 ble en OECD-testretningslinje godkjent for gnagerkometanalysen, og dermed øke akseptabiliteten av analysen for bruk i regulatorisk testing av gentoksisk potensial. Analysen er basert på elektroforetisk separasjon av avslappede DNA-løkker og fragmenter som migrerer fra nukleoider av lysed celler. I utgangspunktet er enkeltceller innebygd i agarose som har blitt lagdelt på mikroskoplysbilder. Lysbilder blir deretter nedsenket i lysisbuffer etterfulgt av en alkalisk (pH> 13) løsning, noe som gjør at det tett kveilet kjernefysiske DNA kan slappe av og slappe av. Lysbilder plasseres deretter i et elektrisk felt, noe som stimulerer migrering av negativt ladet DNA mot anoden, og skaper bilder som ligner kometer; den relative mengden DNA i komethalen sammenlignet med komethodet er direkte proporsjonal med mengden DNA-skade; DNA-innhold i halen kvantifiseres vanligvis ved hjelp av programvare for digital bildebehandling.
Fordi kometanalysen oppdager fragmentert DNA, kan nøyaktig kvantifisering av eksponeringsindusert DNA-skade bli forvirret av kromatinfragmentering forbundet med nekrose eller apoptose som følge av behandlingsindusert cytotoksisitet eller stress. Videre kan DNA-skade oppstå som følge av mekanisk klipping eller feil prøvebehandling4. Betydningen av å opprettholde høstet vev kjølt før lysbildeforberedelse for å minimere baseline nivået av DNA-skade har tidligere blitt vist5,6. Mange laboratorier forbereder kometanalyse lysbilder fra friskt vev; Dette kan imidlertid være logistisk utfordrende når du forbereder lysbilder fra flere vevstyper per dyr i en studie med et stort antall dyr. Videre presenterer dette et problem når lysbildeforberedelse og analyse skal oppstå ved et eksternt laboratorium, noe som krever forsendelse av prøver. For eksempel inkluderer US National Toxicology Program kometanalysen som en del av sitt genetiske toksikologitestprogram (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) og inkluderer noen ganger analysen i 28 eller 90 dagers toksisitetsstudier for gjentatt dosering; Dette nødvendiggjør innsamling av vev ved in-life laboratorium og overføring av prøver til et annet laboratorium for analyse. For å oppnå dette, blir vevsstykker hakket, og / eller epitelceller i mage-tarmkanalen skrapes og cellulære suspensjoner blir flash frosset og lagret i en fryser for etterfølgende forsendelse og lagring av mottakslaboratoriet til analyse7. Riktig håndtering av prøver er avgjørende for å skaffe data av høy kvalitet ved hjelp av frosset vev; Reproduserbar manipulering av vevsprøver under necropsies utført av stadig skiftende personell er imidlertid vanskelig å kontrollere, spesielt ved laboratorier i livet som ikke rutinemessig høster vev for kometanalysen. Oppfriskningsopplæring av necropsy ansatte eller bruk av en mobil enhet bemannet av erfarne laboratoriepersonell for å samle friske eller frosne vevprøver er ofte for kostbart, ikke mulig, eller rett og slett undervurdert.
For bedre å sikre konsekvent generering av høykvalitets vevsprøver for overføring til et eksternt sted for kometanalyseanalyse, ble nytten av en publisert metode6 av vevsbevaring fra flashfrosne kuber av vev utforsket. I denne metoden lastes frosne terninger av vev inn i en rustfritt stål vev skrinsenhet (Figur 1) som er plassert i et mikrocentrifugerør som inneholder kald buffer. Kuben av vev blir deretter presset gjennom et lite målernett på enden av enheten. Gjentatte ganger tvinge vev suspensjon gjennom mesh silen i begge retninger flere ganger resulterer i en relativt ensartet encellede suspensjon. Prøver utarbeidet av denne metoden sammenlignet gunstig i kvalitet til både friske og frosne vevsprøver utarbeidet ved hakking. Som en ekstra fordel, i motsetning til hakkede prøver, kan vevskuber lagres frosset i lengre perioder og fortsatt gi resultater av høy kvalitet i kometanalysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som vist tidligere7,12,13, riktig håndtert flash frosset hakket vev gir gode resultater i kometanalysen. Faktisk er baseline % hale DNA-verdier for frossen hakket rotte og muselever tilberedt i laboratoriet vårt vanligvis ≤6%, som anbefalt av OECD test retningslinje9 for nyhakket rotte leverprøver. Gode resultater har blitt oppnådd av flere laboratorier ved hjelp av en rekke vevstyper som har blitt …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne står i gjeld til Lincoln Martin og Kelley Owens for ekspert teknisk assistanse forbereder og scoring komet lysbilder og Dr. Carol Swartz for å utføre statistiske analyser. Forfatterne anerkjenner også støttende bidrag fra medlemmer av gentoksikologi, undersøkende toksikologi og necropsy programmer ved ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
Riferimenti
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
