Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN
Summary
Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.
Abstract
El ensayo del cometa está ganando popularidad como un medio para evaluar el daño del ADN en las células y tejidos cultivados, particularmente después de la exposición a productos químicos u otros factores estresantes ambientales. El uso del ensayo de cometas en pruebas reglamentarias del potencial genotóxico en roedores ha sido impulsado por la adopción de una directriz de prueba de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) en 2014. Los portaobjetos de ensayo de cometas se preparan típicamente a partir de tejido fresco en el momento de la necropsia; sin embargo, la congelación de muestras de tejido puede evitar desafíos logísticos asociados con la preparación simultánea de diapositivas de múltiples órganos por animal y de muchos animales por estudio. La congelación también permite enviar muestras desde la instalación de exposición a un laboratorio diferente para su análisis, y el almacenamiento de tejido congelado facilita el aplazamiento de la decisión de generar datos de daño de ADN para un órgano determinado. El ensayo del cometa alcalino es útil para detectar roturas de doble y una sola cadena de ADN relacionadas con la exposición, lesiones alcalinas-lábiles y roturas de hebras asociadas con la reparación incompleta de escisión del ADN. Sin embargo, el daño del ADN también puede ser el resultado de cizallamiento mecánico o procedimientos de procesamiento de muestras inadecuados, confundiendo los resultados del ensayo. La reproducibilidad en la recolección y procesamiento de muestras de tejido durante las necropsias puede ser difícil de controlar debido a la fluctuación del personal de laboratorio con diferentes niveles de experiencia en la recolección de tejidos para el ensayo del cometa. Mejorar la coherencia a través de la capacitación de actualización o el despliegue de unidades móviles con personal de laboratorio experimentado es costoso y puede no ser siempre factible. Para optimizar la generación constante de muestras de alta calidad para el análisis de ensayos de cometas, se evaluó un método para homogeneizar cubos de tejido congelados con flash utilizando un dispositivo de picado de tejido personalizado. Las muestras preparadas para el ensayo del cometa por este método se compararon favorablemente en calidad con las muestras de tejido fresco y congelado preparadas por picado durante la necropsia. Además, se midió el daño basal bajo en el ADN en las células de cubos congelados de tejido después de un almacenamiento prolongado.
Introduction
El ensayo del cometa se utiliza cada vez más como un medio para evaluar el daño del ADN en células cultivadas y tejidos expuestos a productos químicos u otros factores de estrés ambientales1. El ensayo puede detectar roturas de doble y una sola cadena de ADN, lesiones alcalinas-lábiles y roturas de una sola cadena asociadas con la reparación incompleta del ADN. La directriz del Consejo Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos de Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) para ensayos farmacéuticos recomienda un ensayo de rotura de hebras de ADN, como el ensayo del cometa como una segunda prueba para complementar el ensayo de micronúcleos de eritrocitos para evaluar la genotoxicidad in vivo y como prueba de seguimiento para evaluar el modo de acción en los órganos diana de la inducción tumoral2. La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) recomienda el ensayo in vivo del cometa como una prueba de seguimiento adecuada para investigar la pertinencia de un resultado positivo en una prueba de genotoxicidad in vitro3. En 2014, se aprobó una directriz de ensayo de la OCDE para el ensayo de cometas de roedores, aumentando así la aceptabilidad del ensayo para su uso en pruebas reglamentarias del potencial genotóxico. El ensayo se basa en la separación electroforética de bucles de ADN relajados y fragmentos que migran de nucleoides de células lysed. Básicamente, las células individuales están incrustadas en agarosa que se ha en capas en las diapositivas del microscopio. Las diapositivas se sumergen en el tampón de lisis seguido de una solución alcalina (pH > 13), que permite que el ADN nuclear estrechamente enrollado se relaje y se relaje. Las diapositivas se colocan en un campo eléctrico, que estimula la migración del ADN cargado negativamente hacia el ánodo, creando imágenes que se asemejan a los cometas; la cantidad relativa de ADN en la cola del cometa en comparación con la cabeza del cometa es directamente proporcional a la cantidad de daño del ADN; El contenido de ADN en la cola se cuantifica típicamente mediante un software de imágenes digitales.
Debido a que el ensayo del cometa detecta ADN fragmentado, la cuantificación precisa del daño del ADN inducido por la exposición puede confundirse por la fragmentación de la cromatina asociada con la necrosis o la apoptosis resultante de la citotoxicidad o el estrés inducidos por el tratamiento. Además, el daño del ADN puede ocurrir como resultado de un cizallamiento mecánico o un procesamiento inadecuado de muestras4. La importancia de mantener el tejido cosechado refrigerado antes de la preparación de la diapositiva para minimizar el nivel basal de daño en el ADN se ha demostrado previamente5,6. Muchos laboratorios preparan diapositivas de ensayo de cometas a partir de tejido fresco; sin embargo, esto puede ser logísticamente difícil al preparar diapositivas de múltiples tipos de tejidos por animal en un estudio con un gran número de animales. Además, esto presenta un problema cuando la preparación y el análisis de diapositivas se producen en un laboratorio remoto, lo que requiere el envío de muestras. Por ejemplo, el Programa Nacional de Toxicología de los Estados Unidos incluye el ensayo del cometa como un componente de su programa de pruebas de toxicología genética (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) y a veces incorpora el ensayo en estudios de toxicidad por dosis repetidas de 28 o 90 días; esto requiere la recolección de tejido por el laboratorio en la vida y la transferencia de muestras a otro laboratorio para su análisis. Para lograr esto, las piezas de tejido se pican, y / o células epiteliales del tracto gastrointestinal se raspan y las suspensiones celulares se congelan y se almacenan en un congelador para su posterior envío y almacenamiento por el laboratorio receptor hasta el análisis7. El manejo adecuado de las muestras es crucial para obtener datos de alta calidad utilizando tejido congelado; sin embargo, la manipulación reproducible de muestras de tejidos durante las necropsias realizadas por personal en constante cambio es difícil de controlar, especialmente en laboratorios de la vida que no cosechan rutinariamente tejidos para el ensayo del cometa. La capacitación más actualizada del personal de necropsia o el uso de una unidad móvil atendida por personal de laboratorio experimentado para recoger muestras de tejido fresco o congelado es a menudo demasiado costosa, no factible, o simplemente infravalorada.
Para asegurar mejor la generación constante de muestras de tejido de alta calidad para su transferencia a un sitio remoto para el análisis de ensayos de cometas, se exploró la utilidad de un método publicado6 de preservación de tejidos a partir de cubos de tejido congelados. En este método, los cubos congelados de tejido se cargan en un dispositivo de picado de tejido de acero inoxidable(Figura 1) que se coloca en un tubo de microcentrífuga que contiene tampón frío. El cubo de tejido se empuja a través de una pequeña malla de calibre al final del dispositivo. Forzando repetidamente la suspensión de tejido a través del tamiz de malla en ambas direcciones varias veces resulta en una suspensión de una sola célula relativamente uniforme. Las muestras preparadas por este método se compararon favorablemente en calidad con muestras de tejido fresco y congelado preparadas por picado. Como beneficio adicional, a diferencia de las muestras picadas, los cubos de tejido se pueden almacenar congelados durante períodos prolongados de tiempo y todavía producen resultados de alta calidad en el ensayo del cometa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se demostró anteriormente7,12,13, tejido picado congelado con flash correctamente manejado proporciona buenos resultados en el ensayo del cometa. De hecho, los valores basales de ADN de cola porcentual para el hígado de rata y ratón picado congelado según lo normal son del 6 %, como se recomienda en la directriz de prueba9 de la OCDE para muestras de hígado de rata recién picada. Se han obtenid…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están en deuda con Lincoln Martin y Kelley Owens por la asistencia técnica de expertos preparando y puntuando diapositivas de cometas y la Dra. Carol Swartz para realizar análisis estadísticos. Los autores también reconocen las contribuciones de apoyo de los miembros de los programas de Toxicología Genética, Toxicología Investigativa y Necropsia en ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
Riferimenti
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