Användning av fryst vävnad i kometanalysen för utvärdering av DNA-skador
Summary
Detta protokoll beskriver flera förfaranden för att förbereda högkvalitativa frysta vävnadsprover vid tidpunkten för obduktion för användning i kometanalysen för att bedöma DNA-skador: 1) hackad vävnad, 2) skrapade epitelceller från mag-tarmkanalen och 3) kubikvävnad prover som kräver homogenisering med hjälp av en vävnadsfärsapparat.
Abstract
Kometanalysen ökar i popularitet som ett sätt att bedöma DNA-skador i odlade celler och vävnader, särskilt efter exponering för kemikalier eller andra miljöfaktorer. Användningen av kometanalysen vid regulatorisk testning av genotoxisk potential hos gnagare har drivits av antagandet av en testriktlinje för Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) 2014. Kometanalys diabilder är vanligtvis beredda från färsk vävnad vid tidpunkten för obduktion; Frysning av vävnadsprover kan dock undvika logistiska utmaningar i samband med samtidig beredning av diabilder från flera organ per djur och från många djur per studie. Frysning möjliggör också att prover från exponeringsanläggningen till ett annat laboratorium för analys kan överföras, och lagring av fryst vävnad underlättar att skjuta upp ett beslut om att generera DNA-skadedata för ett visst organ. Den alkaliska komet analysen är användbart för att upptäcka exponering-relaterade DNA dubbel- och enkelstränga raster, alkali-labile skador och sträng raster i samband med ofullständiga DNA excision reparation. Emellertid, DNA-skador kan också bero på mekanisk klippning eller felaktig prov bearbetning förfaranden, förvirra resultaten av analysen. Reproducerbarhet vid insamling och bearbetning av vävnadsprover under obduktioner kan vara svår att kontrollera på grund av fluktuerande laboratoriepersonal med varierande erfarenhet av att skörda vävnader för kometanalysen. Det är dyrt att förbättra konsekvensen genom repetitionsutbildning eller driftsättning av mobila enheter med erfaren laboratoriepersonal och kanske inte alltid är genomförbart. För att optimera konsekvent generering av högkvalitativa prover för kometanalysanalys utvärderades en metod för homogenisering av flashfrysta kuber av vävnad med hjälp av en anpassad vävnadsfärsapparat. Prover som beretts för kometanalysen med denna metod jämfördes positivt i kvalitet med färska och frysta vävnadsprover som beretts genom malning under obduktion. Dessutom mättes dna-skador med låg baslinje i celler från frysta kuber av vävnad efter långvarig lagring.
Introduction
Kometanalysen används i allt högre grad som ett sätt att utvärdera DNA-skador i odlade celler och vävnader som exponeras för kemikalier eller andra miljöfaktorer1. Analysen kan upptäcka DNA dubbel- och enkelsträngsbrott, alkali-labila lesioner och enstaka strängbrott i samband med ofullständig DNA-reparation. Internationella rådet för harmonisering av tekniska krav för läkemedel för humant bruk (ICH) riktlinje för farmaceutisk testning rekommenderar en DNA-sträng brott analys såsom kometen analysen som ett andra test för att komplettera gnagare erytrocyt mikrokärna analys för bedömning in vivo genoxicitet och som ett uppföljningstest för bedömning av verkningssätt i målorgan av tumör induktion2. Europeiska myndigheten för livsmedelssäkerhet (Efsa) rekommenderar in vivo-kometanalysen som ett lämpligt uppföljningstest för att undersöka relevansen av ett positivt resultat i ett in vitro-genotoxicitetstest3. År 2014 godkändes en OECD-testriktlinje för analysen av kometen för gnagare, vilket ökade acceptansen för analysen för användning vid regulatorisk testning av genotoxisk potential. Analysen är baserad på den elektroforesiska separationen av avslappnade DNA-loopar och fragment som migrerar från nukleoider i lysed celler. I grund och botten är enstaka celler inbäddade i agaros som har skiktats på mikroskop diabilder. Diabilder sänks sedan ned i lysbuffert följt av en alkalisk (pH > 13) lösning, vilket gör att tätt lindade kärn-DNA att slappna av och varva ner. Diabilder placeras sedan i ett elektriskt fält, vilket stimulerar migration av negativt laddade DNA mot anoden, vilket skapar bilder som liknar kometer; Den relativa mängden DNA i kometsvansen jämfört med komethuvudet står direkt i proportion till mängden DNA-skador. DNA-innehåll i svansen kvantifieras vanligtvis med hjälp av digital bildbehandlingsprogram.
Eftersom kometanalysen detekterar fragmenterat DNA kan korrekt kvantifiering av exponeringsinducerad DNA-skada blandas ihop genom kromatinfragmentering som är associerad med nekros eller apoptos till följd av behandlingsinducerad cytotoxicitet eller stress. Dessutom kan DNA-skador uppstå till följd av mekanisk klippning eller felaktig provbearbetning4. Vikten av att bibehålla skördad vävnad kyld före glidpreparering för att minimera baslinjen nivån av DNA-skador har tidigare visat5,6. Många laboratorier förbereda kometanalys diabilder från färsk vävnad; Detta kan dock vara logistiskt utmanande när man förbereder bilder från flera vävnadstyper per djur i en studie med ett stort antal djur. Dessutom utgör detta ett problem när bildberedning och analys ska ske på ett avlägset laboratorium, vilket kräver transport av prover. Till exempel innehåller US National Toxicology Program kometanalys som en del av dess genetiska toxikologiska testprogram (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) och ibland innehåller analysen i 28 eller 90 dagars studier upprepad dos toxicitet; Detta kräver vävnadsinsamling genom in-life-laboratoriet och överföring av prover till ett annat laboratorium för analys. För att åstadkomma detta hackas vävnadsbitar och/eller epitelceller i mag-tarmkanalen skrapas och cellulära suspensioner är flashfrysta och lagras i en frys för efterföljande transport och lagring av det mottagande laboratoriet fram till analys7. Korrekt hantering av prover är avgörande för att få högkvalitativa data med hjälp av fryst vävnad. Reproducerbar manipulering av vävnadsprover under obduktioner som utförs av ständigt föränderlig personal är dock svår att kontrollera, särskilt vid livförsäkringslaboratorier som inte rutinmässigt skördar vävnader för kometanalysen. Repetitionsutbildning av obduktionspersonal eller användning av en mobil enhet bemannad av erfaren laboratoriepersonal för att samla in färska eller frysta vävnadsprover är ofta för dyr, inte genomförbar eller helt enkelt undervärderad.
För att bättre säkerställa konsekvent generering av högkvalitativa vävnadsprover för överföring till en avlägsen plats för kometanalysanalys undersöktes nyttan av en publicerad metod6 för vävnadskonservering från flashfrysta kuber av vävnad. I denna metod lastas frysta kuber av vävnad i en rostfri vävnadsfärsapparat(figur 1)som placeras i ett mikrocentrifugrör som innehåller kallbuffert. Kuben av vävnad trycks sedan genom en liten mätare mesh i slutet av enheten. Upprepade gånger tvingar vävnad suspension genom mesh sikten i båda riktningarna flera gånger resulterar i en relativt enhetlig encellig suspension. Prover som bereds med denna metod jämfördes positivt i kvalitet med både färska och frysta vävnadsprover som bereds genom malning. Som en extra fördel, till skillnad från malet prover, vävnad kuber kan lagras fryst under längre tidsperioder och fortfarande ger hög kvalitet resultat i kometen analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som visat tidigare7,12,13, korrekt hanteras blixt fryst hackad vävnad ger goda resultat i kometen analysen. Faktum är att dna-värden för svansen i svansen vid baslinjen för fryst hackad råtta- och råttalever som framställs i vårt laboratorium är vanligtvis ≤6 %, vilket rekommenderas i OECD:s testriktlinje9 för nyligen malda råttleverprover. Goda resultat har erhållits av flera laboratorier …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna står i skuld till Lincoln Martin och Kelley Owens för expert tekniskt bistånd förbereda och scoring komet diabilder och Dr Carol Swartz för att utföra statistiska analyser. Författarna erkänner också stödjande bidrag från medlemmar av genetisk toxikologi, undersökande toxikologi och obduktion program på ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
Riferimenti
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
