Genredigeringsteknik har gjort det möjligt för forskare att generera zebrafiskmutanter för att undersöka genfunktionen med relativ lätthet. Här ger vi en guide för att utföra parallellembryogenotypning och kvantifiering av in situ hybridiseringsignaler i zebrafisk. Detta opartiska tillvägagångssätt ger större noggrannhet i fenotypiska analyser baserade på in situ hybridisering.
In situ hybridisering (ISH) är en viktig teknik som gör det möjligt för forskare att studera mRNA distribution in situ och har varit en kritisk teknik i utvecklingsbiologi i årtionden. Traditionellt förlitade sig de flesta genuttrycksstudier på visuell utvärdering av ISH-signalen, en metod som är benägen att bias, särskilt i fall där providentiteter är kända a priori. Vi har tidigare rapporterat om en metod för att kringgå denna bias och ge en mer exakt kvantifiering av ISH signaler. Här presenterar vi en enkel guide för att tillämpa denna metod för att kvantifiera uttrycksnivåerna av gener av intresse för ISH-färgade embryon och korrelera det med sina motsvarande genotyper. Metoden är särskilt användbar för att kvantifiera rumsligt begränsade genuttryckssignaler i prover av blandade genotyper och det ger ett opartiskt och korrekt alternativ till de traditionella visuella bedömningsmetoderna.
Införandet av genomredigeringsteknik (ZFN, TALENs och på senare tid, CRISPR/Cas9) har lett till en massiv ökning av antalet laboratorier runt om i världen som använder sig av dessa system för att studera funktionen hos specifika gener in vivo. Zebrafisk i synnerhet är mottagliga för genetisk manipulation och många mutanter har genererats under de senaste1,2. För utvecklingsbiologer är en av de vanligaste metoderna för att bedöma de fenotypiska konsekvenserna av genmutationer i embryonal utveckling in situ hybridisering (ISH). I avsaknad av uppenbara morfologiska defekter som skiljer homozygous mutanter från deras vilda typ eller heterozygous syskon, är det viktigt att korrekt kunna identifiera olika genotypes korrekt.
Klassisk ISH bygger på kvalitativa analyser av signalintensiteter för att dra slutsatser om regelinteraktioner mellan genen av intresse och utvalda markörgener. Även användbara, dessa analyser lider av tekniska variationer och kan vara partisk av forskarnas förväntningar. Således har en metod utvecklats för att kvantifiera genuttryck efter avbildning ISH-färgade embryon, utan förkunskaper om motsvarande genotyp. Detta följdes av en effektiv DNA-extraktion och genotypning som tillät oss att kvantitativt korrelera genotyp med genuttryck3. Medan genotypning av embryon efter ISH har använts före4,5,bildbaserad kvantifiering av ISH mönster har inte använts i stor utsträckning bortsett från ett par studier6,7. De mest populära alternativen förlitar sig på visuella scoring eller räkning av ISH-färgade celler8,9,10, båda benägna att dålig reproducerbarhet och forskare bias. Denna metod är särskilt användbar för att studera förändringar i gener med uttryck mönster som är rumsligt begränsade, såsom runx1 eller gata2b, båda uttryckta i en begränsad delmängd av aortagolv celler som kallas haemogenic endothelium11,12.
Här strävar vi efter att ge en praktisk guide till genomförandet av kvantifieringen genom bildanalys med Fiji13, samt DNA-extraktions- och genotypningsprotokollet. Detta är tänkt att visuellt illustrera vår tidigare publicerade metod3. Vår metod möjliggör en korrekt representation av variationen i genuttryck upptäcks av ISH och en opartisk tilldelning av genuttryck nivåer till specifika genotyper.
Några faktorer bör beaktas när du använder denna metod för att kvantifiera genuttryck. Bildförhållandena måste upprätthållas under hela experimentet (t.ex. belysning, exponeringstider och embryopositionering) för att minska variationen mellan mätningarna. En kritisk punkt är att undvika överfärgning av proverna, eftersom skillnader i färgning mellan prover kan maskeras. Till exempel kan minskningen av VegfA-uttrycket i avsaknad av Eto2 i Xenopus laevis-embryon 30 endast upptäckas genom att noggrant övervaka färgning en 24-timmarsperiod. Således är det god praxis att empiriskt bestämma tillräckliga färgningnivåer för varje gen som bäst representerar dess uttryck, utan att nå mättnad. Overstaining kommer också att artificiellt öka bakgrunden pixelintensiteten i de konverterade 8-bitars gråskalebilder och skeva kvantifieringsresultaten. I extrema fall kan bakgrundsnivån i embryonala vävnader vara högre än ISH-signalen i den valda avkastningen på roi och dessa prover bör uteslutas från analysen. Ett liknande fenomen observerades när vi testade lämpligheten hos den ofärgade äggula för bakgrundskorrigering(figur 4). Efter inversion och konvertering till 8-bitars blir de mörkare pixlarna i äggulan ljusare än ISH-signalen i embryot och gör bakgrundskorrigerade värden negativa. Undvik därför användningen av äggula för bakgrundskorrigering. Mätning av bakgrundssignalen i pigmenterade områden i embryot (t.ex. ögon eller ryggdelen av stammen från 26/28 hpf och framåt) kommer lika snedföra kvantifieringsresultaten och bör också undvikas. Det finns protokoll tillgängliga för blekning zebrafisk embryon, antingen före eller efter ISH18 och blekning embryon äldre än 24 hpf innan avbildning rekommenderas.
Eftersom denna metod bygger på att mäta pixelintensiteten i ett definierat område mot en bakgrundspixelintensitet i ett likvärdigt icke-färgat område, är det inte lämpligt för kvantifiering av allestädes närvarande eller nästan allestädes närvarande uttryckta gener som är. Istället är det väl lämpat för att mäta uttryck för gener med en rumsligt begränsad fördelning där ett område för mätning av bakgrundspixelintensitet kan lätt identifieras. Vår ytterligare analys tyder nu på att använda ett mindre område (3-4x mindre) för bakgrundskorrigering ger liknande resultat som att använda ett likvärdigt område som roi. Detta utökar metodens tillämplighet till gener uttryckta i bredare rumsliga områden (och kräver därmed större roi:er för intensitetsmätningar), så länge man kan använda klart ofläckade områden av embryot för bakgrundskorrigering.
Slutligen föreslår vi att genotypning utföras parallellt eller efter bildkvantitation för att minimera experimenter bias. Att be en andra experimenter att upprepa kvantifieringen på anonymiserade prover och jämföra med den första uppsättningen mätningar kommer också att bidra till att minska experimenterbias. Om de bilder som ska kvantifieras är från en jämförelse mellan behandlingar som inte kräver genotypning (t.ex. vild typ vs kemisk hämmare eller vild typ jämfört med mo knockdown), ska den experimenterare som utför mätningarna förblindas av Prov.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka personalen inom Biomedical Services i Oxford och Birmingham för utmärkt zebrafiskhållning. TD finansierades av en Wellcome Trust kromosom och utvecklingsbiologi phD Stipendium (#WT102345/Z/13/Z). R.M. och M.K. finansierades av British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) och är tacksamma för deras generösa stöd. R.M. erkänner stöd från BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.
0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
Excel | Microsoft | ||
F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
Fiji | |||
Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
Thermocycler | Thermofisher |