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Genetics

Identifier les mutations par fusion à haute résolution dans une population de riz de TILLING

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/59960
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

Summary

Dans cet article, nous présentons le protocole qui est décrit comme l'analyse de fusion à haute résolution (HRM)-basée Sur les lésions locales induites par la cible dans les génomes (TILLING). Cette méthode utilise des changements de fluorescence lors de la fusion du duplex d'ADN et convient au dépistage à haut débit de l'insertion/suppression (Indel) et de la sous-stition de base unique (SBS).

Abstract

Les lésions locales induites par la cible dans les génomes (TILLING) est une stratégie de génétique inversée pour le criblage à haut débit des mutations induites. Cependant, le système TILLING a moins d'applicabilité pour l'insertion / suppression (Indel) détection et traditionnelle TILLING a besoin d'étapes plus complexes, comme CEL I la digestion nucléase et l'électrophorèse gel. Afin d'améliorer l'efficacité du débit et de la sélection, et de rendre possible le dépistage des indels et des sous-stits de base unique (SBS), un nouveau système TILLING à haute résolution est mis au point. Ici, nous présentons un protocole détaillé HRM-TILLING et montrons son application dans le criblage de mutation. Cette méthode permet d'analyser les mutations des amplicons PCR en mesurant la dénaturation de l'ADN à double brin à des températures élevées. L'analyse de la MRH est effectuée directement après la PRC sans traitement supplémentaire. De plus, une méthode d'extraction d'ADN simple, sûre et rapide (SSF) est intégrée à HRM-TILLING pour identifier les Indels et les SBS. Sa simplicité, sa robustesse et son débit élevé le rendent potentiellement utile pour la numérisation des mutations dans le riz et d'autres cultures.

Introduction

Les mutants sont d'importantes ressources génétiques pour la recherche en génomique fonctionnelle des plantes et l'élevage de nouvelles variétés. Une approche génétique avancée (c.-à-d. de la sélection mutante au clonage génétique ou au développement de variétés) était la principale et la seule méthode pour l'utilisation des mutations induites il y a environ 20 ans. Le développement d'une nouvelle méthode de génétique inversée, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) par McCallum et coll.1 a ouvert un nouveau paradigme et il a depuis été appliqué dans un grand nombre d'espèces animales et végétales2. TILLING est particulièrement utile pour les caractères de reproduction qui sont techniquement difficiles ou coûteux à déterminer (p. ex., résistance aux maladies, teneur en minéraux).

TILLING a été initialement développé pour les mutations de points de dépistage induites par les mutagènes chimiques (p. ex., SME1,3). Il comprend les étapes suivantes : l'établissement d'une population DE TILLING(s); Préparation de l'ADN et mise en commun de plantes individuelles; Amplification pcR du fragment d'ADN cible; formation d'hétéroduplexes par dénaturation et annealing des amplicons de PCR et du clivage par la nucléase de CEL I ; et l'identification des individus mutants et de leurs lésions moléculaires spécifiques3,4. Cependant, cette méthode est encore relativement complexe, longue et faible débit. Pour le rendre plus efficace et avec un débit plus élevé, de nombreuses méthodes DE TILLING modifiées ont été développées, telles que la suppression DETILLING (De-TILLING) (Tableau 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

L'analyse de la courbe de la MRH, qui est basée sur les changements de fluorescence lors de la fusion du duplex d'ADN, est une méthode simple, rentable et à haut débit pour le dépistage des mutations et le génotypage13. La MRH a déjà été largement utilisée dans la recherche sur les plantes, y compris la MRH TILLING (HRM-TILLING) pour le dépistage des mutations SBS induites par la mutagénèse du SME14. Ici, nous avons présenté des protocoles détaillés HRM-TILLING pour le criblage des mutations (Indel et SBS) induites par les rayons gamma () dans le riz.

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Protocol

1. Préparations

  1. Développement de populations mutagénaires
    1. Traiter environ 20 000 graines de riz séchées (avec une teneur en humidité d'environ 14 %) d'une ligne de riz japonica (p. ex. DS552) avec 137rayons gamma Cà à 100 Gy (1 Gy/min) dans une installation d'irradiation (p. ex. cellule gamma).
      REMARQUE: Les graines utilisées pour le traitement devraient avoir une viabilité élevée (p. ex., avec un taux de germination à 85 %). La dose d'irradiation pour le riz indica pourrait être augmentée à 150 Gy.
    2. Semez les graines irradiées après la germination sur un lit de semis et transplantez les semis individuellement dans un champ de rizières et dexaissent dans la population M1.
      REMARQUE: L'ensemencement direct des plantes M1 pourrait également être appliqué pour économiser le coût de la main-d'œuvre. Empêcher le croisement des plantes M1 avec d'autres variétés de riz en utilisant des moyens d'isolement physique ou biologique.
    3. Récolte en vrac M2 graines des plantes M1, avec 1-2 graines de chaque panique M1, pour former une population M2.
      REMARQUE : Dans la pratique et pour la simplicité, récolter toutes les graines de plantes M1 et après avoir mélangé complètement, une portion est échantillonnée pour former une population M2.
    4. Faire tremper environ 5 000 M2 graines dans de l'eau pour 24 (riz indica)-36 (riz japonica) h à température ambiante. Ensuite, laissez les graines germer à 37 oC pendant 2 jours sur du papier filtre humide dans les plats Petri.
      REMARQUE: Plus de graines De M2 peuvent germer pour analyse afin d'augmenter la probabilité d'identifier les mutants.
    5. Placez les graines germées sur des panneaux d'ensemencement avec de petits trous et faites-les pousser hydroponiquement pendant 3-4 semaines dans une solution de culture modifiée à partir de Yoshida et al.15 dans une serre avec une photopériode de 12 h [diurne (30'2) et nuit (24'2) 'C]..
  2. Échantillonnage des tissus foliaires : Couper un disque (2 mm) de la feuille entièrement étendue de chaque ensemencement à la même position à l'aide d'un poinçonneur de trou.
  3. Préparation des solutions d'extraction d'ADN
    1. Tampon A: Ajouter 2 mL de 5 M NaOH et 10 ml de 20% Tween 20 pour faire le volume final de 50 ml. Préparer fraîchement le tampon A avant l'extraction de l'ADN.
    2. Tampon B : Ajouter 20 ml de 1 M Tris-HCl (pH 8,0) et 80 OL de 0,5 M EDTA pour faire un volume final de 100 ml.
  4. Amorces PCR
    1. Amorces pour l'analyse de la MRH : Concevoir des amorces pour l'amplification de la séquence cible à l'aide d'un logiciel (p. ex., Primer Premier5) et synthétiser par une entreprise commerciale.
      REMARQUE: Étant donné que la MRH est moins applicable à l'analyse de longs fragments, et que, par conséquent, les amplicons doivent être inférieurs à 400 pb. Fragments avec trop élevé (-75 %) ou trop bas (lt;25%) Le contenu du GC n'est pas non plus bon pour l'analyse de la MRH.
    2. Amorces pour le contrôle de la qualité : Utilisez les 24 marqueurs SSR distribués sur les 12 chromosomes de riz de Peng et coll.16.

2. Extraction d'ADN

  1. Placer 4 disques de feuilles dans chaque puits d'une plaque PCR de 96 puits, ajouter la solution tampon A (50 ml/puits). Congeler l'assiette dans un congélateur de -80 oC pendant 10 min.
  2. Dégeler l'assiette à température ambiante, puis couver à 95 oC pendant 10 min.
  3. Ajouter 50 ll de tampon B à chaque puits et bien mélanger par vortex.
  4. Centrifuger la plaque pendant 1 min à 1 500 x g. Le supernatant est prêt pour PCR.

3. Amplification DE PCR

  1. Optimisation PCR
    1. Ajoutez les réactifs suivants à chaque puits PCR : 1 L d'ADN (le supernatant à l'étape 2,4), 5 l de 2x Master Mix (contenant 2x tampon PCR, 4 mmol/L MgCl2, 0,4 mmol/L 2'-deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP), et 50 U/mL Taq polymère DNAase, 0,2 l chacun de 10 amorces de mol/L, et faire un volume final jusqu'à 10 l en utilisant de l'eau sans nucléaris.
    2. Utiliser un bloc thermique capable de gradient pour déterminer la température d'annealing optimale pour chaque fragment cible en utilisant le programme PCR suivant : 5 min à 94 oC, suivi de 40 cycles de 30 s à 94 oC, 30 s à 52-62 oC (température de gradient) et 30 s à 72 oC , avec une extension finale à 72 oC pour 8 min et une cale à 16 oC.
    3. Examinez les amplicônes sur les gels d'agarose de 1 % pour déterminer la température d'annealing optimale.
      REMARQUE: Une température d'annealing optimale devrait permettre une amplification spécifique du fragment cible, sans amplification non spécifique et dimerisation des amorces.
  2. PCR pour l'analyse DE la MRH
    REMARQUE: Les plaques compatibles AVEC la MRH et l'ADN des semis M2 extraits tels que décrits à l'étape 2.4 sont utilisés pour le PCR.
    1. Effectuez des PCR dans un volume final de 10 L, avec 1 L d'ADN (supernatant), 5 L de 2x Master Mix, 0,2 L chacun de 10 amorces de mol/L, et 1 l de colorant de fluorescence 10x. Dans chaque plaque, on compte un échantillon de type sauvage (WT) et un échantillon négatif (sans ADN).
    2. Ajouter une goutte d'huile minérale à chaque puits pour éviter l'évaporation.
    3. Sceller la plaque avec du film adhésif et une centrifugeuse à 1 000 x g pendant 1 min.
    4. Exécutez le PCR en utilisant la température d'annealing optimisée.
      REMARQUE: Dans quelques cas, le colorant de fluorescence peut affecter l'amplification de PCR, d'où le colorant est ajouté après l'achèvement de PCR. Dans de tels cas, le colorant est incorporé dans les brins d'ADN par la dénaturation et l'annexion post-PCR.

4. Confirmation de la numérisation et de la mutation de la MRH

  1. Retirez le film adhésif de la plaque et insérez la plaque dans une machine DE MRH.
  2. Sélectionnez New Run dans le menu de fichiers ou appuyez sur le bouton Exécuter en haut de l'écran.
  3. Préciser les températures de départ et de fin de la fonte de 55 à 95 oC.
    REMARQUE: Après la première manche, la plage de température de fonte peut être déterminée pour un fragment particulier; par conséquent, la température de fonte peut être ajustée pour l'analyse ultérieure du même fragment pour gagner du temps.
  4. Sélectionnez des échantillons pour l'analyse de fusion à haute résolution, excluez les échantillons semblables au contrôle négatif.
  5. Normaliser les courbes de fusion pour avoir la fluorescence de début et de fin. Confirmez visuellement que les curseurs de température de Min et de Max inférieur sont dans une région des courbes.
  6. Maintenir le niveau F (différence de fluorescence) au paramètre par défaut de 0,05.
  7. Sélectionnez le Common versus Variant dans la liste de sélection des normes et choisissez la sensibilité normale.
  8. Utilisez le WT comme contrôle; les échantillons d'une valeur F de 0,05 wT sont considérés comme contenant des plantes mutantes.
  9. Identification et confirmation des plantes mutantes.
    1. Identifier les quatre plantes, dont chaque piscine mutante a été faite.
    2. Extraire l'ADN de chacune de ces plantes en utilisant une méthode CTAB selon Allen et al.17 avec quelques modifications.
      REMARQUE: RNase et NaAc sans DNase ne sont pas utilisés pour extraire de l'ADN à l'aide de la méthode CTAB décrite par Allen et coll.17, car la qualité de l'ADN est assez bonne pour une amplification pcR ultérieure. Ajuster l'ADN à une concentration finale de 25 ng/L après quantification à l'aide d'un spectrophotomètre.
    3. Amplifiez le fragment cible à l'aide d'amorces PCR et programmez le même que pour l'analyse de la MRH.
    4. Identifier les lésions moléculaires spécifiques par séquençage de Sanger des amplicons.
      REMARQUE: Une fois l'amplification de PCR terminée, envoyez les amplicons à une entreprise pour le séquençage De Sanger. La lésion moléculaire peut être identifiée en comparant les séquences entre la plante M2 et le WT.

5. Contrôle de la qualité des mutants sélectionnés avec des marqueurs moléculaires

  1. Effectuer le PCR pour les 24 marqueurs SSR dans un volume final de 10 L avec 25 ng d'ADN génomique (extrait à l'aide du protocole CTAB), 5 l de mix maître 2x, 0,2 L de chacun des 10 amorces SSR M.
  2. Exécuter PCR en utilisant le programme suivant: 5 min à 94 oC, suivi de 30 cycles de 30 s à 94 oC, 30 s à 55 oC et 30 s à 72 oC, avec une extension finale à 72 oC pendant 7 min.
  3. Séparer les amplicons sur 8% gels polyacrylamide et révéler le polymorphisme des fragments amplifiés par la colorationargent18.
  4. Comparez les haplotypes SSR de variantes sélectionnées et le WT.
    REMARQUE: Les mutants induits ont souvent des haplotypes SSR identiques à leur WT, si plus d'un marqueur SSR est différent entre une variante et le WT, la variante est élevée susceptible d'être un contaminant génétique (par exemple, un mélange ou une plante croisée) plutôt qu'une mutant18.

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Representative Results

Numérisation et analyse de la MRH

Au total, 1 140 échantillons d'ADN mis en commun provenant de 4 560 semis M2 ont été produits et soumis à l'amplification du PCR. Deux fragments de la taille de 195 bp et 259 bp ont été amplifiés pour OsLCT1 et SPDT, respectivement (tableau 2). La plupart des échantillons présentaient des courbes de fusion qui n'étaient pas significativement différentes de la WT (F 'lt; 0,05). Les courbes de LA HRM sensiblement différentes de la WT (F 'gt; 0.05) ont été regroupées avec la couleur (s) différent de la WT par le logiciel (Figure 1).

Confirmation et fréquence des mutations

Un échantillon d'ADN d'un semis individuel a été utilisé pour l'amplification et le fragment respectif a été séquencé. Le type de mutation et la position sur les gènes pourraient être confirmés par les chromatogrammes de séquençage (Figure 2). Trois mutations, dont deux Indels et un SBS, ont été identifiées à partir de 4 560 semis M2 (tableau2). On a découvert que les trois parties mutantes étaient hétérozygotes sur le site de la mutation (figure 2).

La fréquence de mutation ici appelée la fréquence de mutation s'est produite dans le génome dans une population de TILLING. Basé sur la formule ci-dessous, il a été constaté que la fréquence de mutation s'élevait à environ 1/690 kb.

Equation 1

Figure 1
Figure 1 : HRM-TILLING de M2 Seedlings for Mutations in OsLCT1 (A, B) ou SPDT (C) Genes. Le type sauvage a été choisi comme référence pour le développement des courbes de différence de fluorescence. Les mutants ont montré des courbes de HRM significativement différentes avec 'F s 'gt; 0.05 à des températures de 90.0-92.0 'C et 81.5-83.5 'C, respectivement. Ce chiffre a été modifié à partir de Li et coll.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Séquençage des chromatogrammes de fragments ciblés de mutants. La boîte rectangulaire indique un site hétérozygote avec une mutation de G-A à 4304 bp d'OsLCT1 (A); un seul nucléotide Une insertion au 4240 bp d'OsLCT1 est indiquée par une flèche (B); et une suppression de trinucleotide TTC à la position de 5948-5950 bp de SPDT est indiquée par une ligne noire (C). Ce chiffre a été modifié à partir de Li et coll.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

abréviation nom Avantages ou applicabilité Inconvénients référence
TILLING traditionnel Cibler les lésions locales induites dans les génomes Pour les mutations de points de dépistage Temps et coût McCallum et coll., 2000; Till et coll., 2003
Eco-TILLING Ecotype-TILLING Pour le dépistage des mutations dans les populations naturelles Coûteux et faible sensibilité Comai et coll., 2004
De-TILLING Suppression TILLING Pour le dépistage de la grande suppression Dépend fortement d'un bon système PCR Rogers et coll., 2009
iTILLING (en) TILLING individualisé Identification des mutations à l'aide de populations TIILLING personnalisées Population non permanente Bush et Krysan, 2010
DHPLC-TILLING Dénaturation de la chromatographie liquide haute performance - basée sur TILLING Gain de temps Faible débit Colasuonno et coll., 2016
Seq-TILLING (En) TILLING par séquençage Haut débit, système non-enzymatique Relativement coûteux et plus élevé faux positif Tsai et coll., 2011; Kumar et coll., 2017
HRM-TILLING Fusion haute résolution-TILLING Haut débit et gain de temps; Système non-enzymatique Limite de longueur du fragment PCR Dong et coll., 2009; Gady et coll., 2009

Tableau 1 : Les avantages et les inconvénients des diverses approches DE TILLING.

Nom du gène Gène Loci Fonction génique Séquence d'apprêt (5'-3') Tm après optimisation (C) Taille du produit (bp) Nombre de mutations (type mutation)
OsLCT1 (en) LOC-Os06g38120 Transporteur à faible teneur en cadmium LCT-F: CTCGATGTTAAGCATGCTCC LCT-R: AGAGTCAGGAACGCGGCTAC 61 195 2 (transition G-A, insertion 1-bp)
Spdt LOC-Os06g05160 Transporteur de distribution de phosphore de la sulTR SPDT-F: TTCTCGGAGGAGGCTAAT SPDT-R: CCACGCATTTTGGTTACAT 52 259 1 (suppression de 3 pb)

Tableau 2 : Information de deux gènes cibles, amplification du PCR et mutations identifiées.

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Discussion

TILLING s'est avéré être un puissant outil génétique inversé pour identifier les mutations induites pour l'analyse fonctionnelle des gènes et la sélection des cultures. Pour certains traits qui ne sont pas faciles à observer ou à déterminer, TILLING avec la détection de mutation à haut débit à base de PCR peut être une méthode utile pour obtenir des mutants pour différents gènes. La méthode HRM-TILLING a été utilisée dans les populations mutagérisées de SME de la tomate12,du blé11 et de la vigne20 pour le dépistage des mutations. Dans cet article, un HRM-TILLING plus simple et plus puissant a été démontré, applicable pour le criblage de mutation d'Indel et de SBS.

Pour améliorer l'efficacité, les AID ont été extraits en utilisant la méthode SSF au lieu de la méthode régulière CTAB, qui est de temps et de travail et nécessite des agents chimiques toxiques. Si et coll.21 ont comparé la qualité de l'ADN extrait à l'aide de la méthode SSF et CTAB. Bien qu'il ait été constaté que l'ADN de l'extraction SSF avait une pureté inférieure à celle de l'extraction CTAB, il pourrait répondre aux exigences de PCR et pour l'analyse de la MRH dans le riz. Cependant, il convient de noter que l'ADN de l'extraction SSF ne pouvait pas être stocké pendant une longue période, d'où il n'est pas approprié pour établir une bibliothèque mutante permanente.

Dans une étude précédente, les échantillons mis en commun avec 1/8 d'ADN mutant pouvaient être différenciés du type sauvage par l'analyse de la MRH dans les populations mutagénaires et gamma14,19. Considérant que les plantes M2 pourraient être hétérozygotes pour les mutations induites, la mise en commun de quatre plantes M2 a été recommandée pour détecter les mutations par HRM-TILLING.

Pour obtenir plus de mutants, il est également essentiel de développer des populations mutagéisées avec une fréquence de mutation élevée. Les rayons gamma ont eu un effet significatif sur la croissance des plantes M 1. Il a été rapporté que le traitement avec une dose plus élevée a eu comme conséquence la fréquence accrue des mutants chlorophylle-déficients et la performance inférieure de la fertilité, de l'ensemble de graine et de la hauteur de plante dans les usines de M2 18. En outre, on savait que la tolérance aux mutagènes variait d'une espèce à l'autre. Par conséquent, la dose ayant pour résultat environ 50% de létalité (LD50) dans les usines De M1 a été considérée comme la dose optimale d'irradiation. Cependant, Li et coll. ont trouvé différentes doses de mutation (165, 246 et 389 Gy) ont eu comme conséquence des taux de mutation semblables dans le génome entier par le resequencing, qui a impliqué une faible dose pourrait être appliquée pour produire des mutations22.

Cet article a montré l'exemple de HRM-TILLING pour le criblage de mutation des usines induites par gamma. Le HRM-TILLING décrit dans cet article devrait également être applicable pour des mutations de criblage dans les populations SME-mutagéisées.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0102103) et la National Natural Science Foundation of China (No.31701394).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

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References

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