JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Genetica

En robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-Trinucleotid gentages i skrøbelig X mental retardering-1 gen

Published: September 16, 2019
doi:
10.3791/59963
, , , , , , , , , ,
1Central Laboratory, Bao’an Maternity and Child Health Hospital,Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology,The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute,The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism,Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao’an Maternity and Child Health Hospital,Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao’an Maternity and Child Health Hospital,Jinan University

Summary

En nøjagtig og robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-trinucleotid gentager i den skrøbelige X mental retardering-1-gen letter Molekylær diagnose og screening af skrøbeligt X-syndrom og skrøbelige X-relaterede problemer med kortere tid og investeringer i udstyr.

Abstract

Skrøbelige X syndrom (FXS) og tilknyttede lidelser er forårsaget af udvidelse af cytosin-guanin-guanin (CGG) trinucleotid Gentag i 5 ‘ ikke oversat region (UTR) af den skrøbelige X mental retardering-1 (FMR1) gene Promoter. Konventionelt, kapillar elektroforese fragment analyse på en genetisk analysator anvendes til dimensionering af CGG gentagelser af FMR1, men yderligere sydlige blot analyse er nødvendig for nøjagtig måling, når gentagelses tallet er højere end 200. Her præsenterer vi en nøjagtig og robust polymerase kædereaktion (PCR)-baseret metode til kvantificering af CGG gentagelser af FMR1. Det første trin i denne test er PCR amplifikation af gentagelses sekvenserne i 5 ‘ UTR af FMR1 -promotoren ved hjælp af et skrøbeligt X PCR-kit, efterfulgt af rensning af PCR-produkterne og fragment dimensionering på et mikrofluidisk kapillar-elektroforese-instrument, og efterfølgende fortolkning af antallet af CGG gentager ved at referere standarder med kendte gentagelser ved hjælp af Analysis software. Denne PCR-baserede analyse er reproducerbar og i stand til at identificere hele spektret af CGG-gentagelser af FMR1 -promotorer, herunder dem med et gentagelses nummer på mere end 200 (klassificeret som fuld mutation), 55 til 200 (premutation), 46 til 54 (mellemliggende) og 10 til 45 (normal). Det er en omkostningseffektiv metode, der letter klassificeringen af FXS og skrøbelige X-associerede lidelser med robusthed og hurtig rapporteringstid.

Introduction

Skrøbelige X syndrom (FXS) og skrøbelige X associerede lidelser, f. eks, tremor og ataksi syndrom (FX-TAS), og primær ovarie insufficiens (FX-POI) er primært forårsaget af cytosin-guanin-guanin (CGG) trinucleotid gentagen ekspansion i 5 ‘ uoversat region (UTR) for den skrøbelige X mental retardering-1 (FMR1) gen på XQ 27.31,2. Det FMR1 kodede protein (fmrp) er et polyribosome-associeret RNA-bindende protein, der fungerer i neuronal udvikling og synaptisk plasticitet ved at regulere alternative splicing, stabilitet og dendritisk transport af mRNA eller moduerende syntese af partielle postsynaptiske proteiner3,4,5,6,7.

Den dynamiske variation med en CGG-gentagelses størrelse på > 200 beskrives som fuld mutation, hvilket inducerer den afvigende hypermethylering og efterfølgende transkriptional hæmning af FMR1 Promoter8. Den deraf følgende fravær eller mangel på FMPS-proteinet forstyrrer normal neuronal udvikling og forårsager FXS9, karakteriseret ved forskellige kliniske symptomer, herunder moderat til svær intellektuel invaliditet, udviklingsmæssige forsinkelser, hyperaktiv adfærd, dårlige kontakter og autistiske manifestationer10,11,12. Præsentationen hos kvindelige FXS patienter er generelt mildere end den hos mænd. CGG-gentagelses størrelsen, der spænder fra 55 til 200 og 45 til 54, klassificeres som henholdsvis præmutation og mellemliggende status. På grund af den høje grad af ustabilitet, CGG gentage størrelse i en premutation eller mellemliggende allel formentlig udvider når overføres fra forældre til afkom13,14. Således er bærere med præmutation alleler i høj risiko for at få børn ramt af FXS på grund af gentagen ekspansion, og i nogle tilfælde kan mellemliggende alleler udvide deres gentagelses størrelse til hele Mutations området over to generationer15, 16. Desuden, mænd med premutation også formidle øget risiko for at udvikle sent-debut fx-tas17,18,19, mens præmutation hunner er disponerede for både fx-tas og fx-POI20, 21,22. For nylig er det blevet rapporteret, at autistiske spektrum lidelser med udviklingsmæssige forsinkelse og problemer i social adfærd er præsenteret hos børn med premutation FMR1 alleler23,24.

For at bestemme den nøjagtige CGG gentagelse størrelse er af stor betydning for klassificering og forudsigelse af FXS og skrøbelige X-associerede lidelser25,26. Historisk, CGG gentage region-specifikke polymerase kædereaktion (PCR) med fragment dimensionering plus Southern blot analyse har været den gyldne standard for Molekylær profil af FMR1 CGG Gentag27. Men, traditionel specifik PCR er mindre følsom over for store præmutationer med mere end 100 til 130 gentagelser og er ude af stand til at forstærke fuld mutationer27,28. Desuden undlader kapillær elektroforese på en traditionel genetisk analysator til gentagen dimensionering at detektere FMR1 PCR-produkter med mere end 200 CGG-gentagelser. Southern blot-analysen gør det muligt at differentiere en bredere vifte af gentagelses størrelser, fra normal til fuld mutation gentagne tal, og er blevet meget brugt til at bekræfte fuld mutationer (hos mænd) og differentiere heterozygot alleler med en fuld mutation fra tilsyneladende homozygot alleler med normale gentagelses størrelser (hos kvinder). Beslutningen om at kvantificere gentagelserne er dog begrænset. Endnu vigtigere er, at denne trin-for-trintest strategi er arbejdskraftintensiv, tidskrævende og omkostningseffektiv.

Her præsenterer vi en nøjagtig og robust PCR-baseret metode til kvantificering af CGG-gentagelserne af FMR1. Det første trin i denne test er PCR-forstærkning af gentagelses sekvenserne i 5 ‘ UTR for FMR1 -arrangøren ved hjælp af et skrøbeligt X PCR-sæt. PCR-produkterne er renset og fragment dimensionering udføres på et mikrofluidisk kapillar-elektroforese instrument, og efterfølgende fortolkning af antallet af CGG gentages ved hjælp af analysesoftwaren ved at referere til standarder med kendte gentagelser baseret på begrundelse, at PCR fragment længde er direkte proportional med antallet af CGG gentagelser. PCR-systemet omfatter reagenser, der letter amplificeringen af den meget GC-rige trinucleotid-gentagelses region. Denne PCR-baserede analyse er reproducerbar og i stand til at identificere alle intervaller af CGG gentagelser af FMR1 promotorer. Dette er en omkostningseffektiv metode, der kan finde bred anvendelse i molekylær diagnose og screening af FXS og skrøbelige X-relaterede lidelser med mindre turn-around tid og investeringer i udstyr og dermed, kan udnyttes i et bredere spektrum af kliniske Laboratorier.

Protocol

Etisk godkendelse blev givet af det fælles kinesiske universitet i Hongkong — nye territorier East Cluster klinisk forskning etiske komité (reference nummer: 2013,055) 1. PCR amplifikation Før start skal du fjerne PCR-buffer blanding, prøvefortynder og DNA-prøver (både test-og reference-DNA) (Se tabellen over materialer) fra-20 °c-fryseren og opbevare dem ved stuetemperatur i 20-30 minutter for at sikre, at alle reagenser og DNA er helt optøede. Vortex, og …

Representative Results

Størrelses resultaterne af den formutation kvindelige referenceprøve (NA20240, gentagne størrelser på 30 og 80) og den fulde mutation kvindelige referenceprøve (NA20239, gentagne størrelser på 20 og 200) er vist i henholdsvis figur 1a og figur 1b. Typisk er to markør toppe (nedre markør 50 base Pairs [BP] og øvre markør 10.380 BP) inkluderet i fragment størrelses profilen. Der er normalt en primer kompleks peak med en størrelse på næsten 95 BP. Ge…

Discussion

FXS er den næstmest almindelige årsag til intellektuel svækkelse efter trisomi 21, der tegner sig for næsten halvdelen af X-linked mental retardering30, som kan forekomme hos ca. 1 ud af 4.000 hanner og 1 ud af 8.000 hunner. Endnu vigtigere, næsten 1 ud af 250 – 1000 kvinder bære en formutation, og denne frekvens er 1 i 250 – 1600 i mænd26,31,32,33. Da risikoe…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning blev støttet af tilskud fra NSFC Emergency Management Project (Grant No. 81741004), Kinas National Natural Science Foundation (Grant No. 81860272), den store forsknings plan for provins videnskab og teknologi Foundation i Guangxi ( Giv nr. AB16380219), China postdoc Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) og Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent PerkinElmer In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mix PerkinElmer In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase Polymerase PerkinElmer In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis software PerkinElmer
NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer Thermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate MACHEREY-NAGEL 743100
reference DNA sample Coriell NA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal Cycler Bio-Rad 1852196 This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrument PerkinElmer 1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Life Technologies 10977015 For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0256 (Model G560E) Conventional vortex mixer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d’endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene–and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Tags

PCR AssayFragile X Mental Retardation-1 GeneCGG Trinucleotide RepeatsMolecular DiagnosisFragile X SyndromeFragile X-related DisordersCost-effectiveRapid ReportingDNA Sample PreparationPCR Master MixPCR Cleanup
check_url/it/59963?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image