En robust Polymerase kedjereaktion-baserad analys för att kvantifiera cytosin-guanine-Guanintrinukleotidrepetitioner i bräcklig X mental retardation-1 gen
Summary
En noggrann och robust polymeras kedjereaktion-baserad analys för kvantifiering av cytosin-guanin-guanintrinukleotidrepetitioner i den bräckliga X mental retardation-1 genen underlättar molekylär diagnos och screening av bräckligt x-syndrom och bräckliga x-relaterade störningar med kortare turn-around tid och investeringar i utrustning.
Abstract
Bräckliga X syndrome (FXS) och tillhörande sjukdomar orsakas av expansion av cytosin-guanin-guanine (CGG) trinukleotide upprepa i 5 ‘ oöversatta regionen (UTR) av bräckliga X mental retardation-1 (FMR1) Gene promotor. Konventionellt, kapillär elektrofores fragment analys på en genetisk analysator används för dimensionering av CGG repetitioner av FMR1, men ytterligare Southern blot-analys krävs för exakt mätning när upprepnings numret är högre än 200. Här presenterar vi en noggrann och robust polymeras kedjereaktion (PCR)-baserad metod för kvantifiering av CGG-repetitionerna av FMR1. Det första steget i detta test är PCR-förstärkning av upprepningssekvenserna i 5 ‘ utr av FMR1 promotorn med hjälp av en bräcklig X PCR-sats, följt av rening av PCR-produkterna och fragmentdimensionering på ett mikroflödessystem kapillärelektrofores instrument, och efterföljande tolkning av antalet CGG upprepar genom att hänvisa till standarder med kända upprepningar med hjälp av analysprogram varan. Denna PCR-baserade analys är reproducerbar och kan identifiera hela sortimentet av CGG repetitioner av FMR1 initiativtagare, inklusive de med ett upprepa antal mer än 200 (klassificeras som full mutation), 55 till 200 (premutation), 46 till 54 (mellanliggande), och 10 till 45 (normal). Det är en kostnadseffektiv metod som underlättar klassificeringen av FXS och bräckliga X-relaterade störningar med robusthet och snabb rapporterings tid.
Introduction
Bräcklig x syndrome (FXS) och bräcklig x förbundet sjukdom, e.g., tremor och ataxi syndrome (FX-tas), och primär ovariell insufficiens (FX-POI) är huvudsakligen orsakat vid cytosine-guanine-guanin (CGG) trinucleotide upprepa utbredande i den 5 ‘ oöversatt region (UTR) av den bräckliga X mental retardation-1 (FMR1) genen på XQ 27,31,2. Den FMR1 Encoded protein (fmrp) är en polyribosome-associerade RNA-bindande protein som fungerar i neuronala utveckling och synaptisk plasticitet genom att reglera alternativa skarvning, stabilitet, och dendritiska transport av mRNA eller modulerande syntes av partiella postsynaptiska proteiner3,4,5,6,7.
Den dynamiska variationen med en CGG-repetitionsstorlek på > 200 beskrivs som full mutation, vilket inducerar den avvikande hypermetyleringen och efterföljande transkriptionell ljuddämpning av FMR1 -promotorn8. Den resulterande frånvaron eller avsaknaden av FMRP protein stör normal neuronala utveckling och orsakar FXS9, kännetecknas av olika kliniska symtom, inklusive måttlig till svår intellektuell funktionsnedsättning, utvecklingsförsening, hyperaktiva beteenden, dåliga kontakter och autistiska manifestationer10,11,12. Presentationen i kvinnliga FXS patienter är i allmänhet mildare än den hos män. Den CGG upprepa storlek som sträcker sig från 55 till 200 och 45 till 54 klassificeras som premutation och mellanliggande status, respektive. På grund av den höga graden av instabilitet, CGG upprepa storlek i en premutation eller mellanliggande allel förmodligen expanderar när de överförs från föräldrar till avkomma13,14. Således, bärare med premutation alleler är på hög risk att få barn som drabbats med FXS på grund av upprepad expansion, och i vissa fall, mellanliggande alleler kan utöka sin upprepning storlek till hela Mutations området över två generationer15, 16. Dessutom, hanar med premutation också förmedla ökad risk att utveckla sena debut FX-tas17,18,19, medan premutation honor är predisponerade för både FX-tas och FX-POI20, 21,22. Nyligen har det rapporterats att autistiska spektrum störningar med utvecklingsförsening och problem i sociala beteenden presenteras hos barn med premutation FMR1 alleler23,24.
För att bestämma den exakta CGG upprepa storlek är av stor betydelse för klassificering och förutsägelse av FXS och bräckliga X-associerade störningar25,26. Historiskt, CGG upprepa regionspecifika polymeras kedjereaktion (PCR) med fragment dimensionering plus Southern blot analys har varit den gyllene standarden för molekylär profilering av FMR1 CGG upprepa27. Emellertid är traditionell specifik PCR mindre känsligt till stora premutationer med mer än 100 till 130 repetitioner och är oförmögen att förstärka fulla mutationer27,28. Dessutom, kapillärelektrofores på en traditionell genetisk analysator för upprepad dimensionering inte upptäcka FMR1 PCR-produkter med mer än 200 CGG upprepar. Den Southern blot-analys möjliggör differentiering av ett bredare spektrum av upprepnings storlek, från normal till full mutation upprepa siffror, och har använts i stor utsträckning för att bekräfta full mutationer (hos män) och differentiera heterozygot alleler med en fullständig mutation från Tydligen homozygot alleler med normal upprepning storlekar (hos kvinnor). Upplösningen för att kvantifiera upprepningar är dock begränsad. Ännu viktigare, denna steg-för-steg teststrategi är arbetsintensiva, tidskrävande, och kostnadseffektiva.
Här presenterar vi en noggrann och robust PCR-baserad metod för kvantifiering av CGG: s upprepningar av FMR1. Det första steget i detta test är PCR amplifiering av upprepningssekvenser i 5 ‘ UTR av FMR1 promotorn med bräcklig X PCR kit. PCR-produkterna renas och fragmentdimensionering utförs på en mikroflödessystem kapillärelektrofores instrument, och efterföljande tolkning av antalet CGG upprepar med hjälp av analysprogramvara genom att hänvisa till standarder med kända upprepningar baserat på motivering till att PCR-Fragmentets längd är direkt proportionell mot antalet repetitioner av CGG. PCR-systemet inkluderar reagenser som underlättar amplifiering av den mycket GC-rika trinukleotide REPEAT-regionen. Denna PCR-baserade analysen är reproducerbar och kan identifiera alla intervall av CGG upprepningar av FMR1 initiativtagare. Detta är en kostnadseffektiv metod som kan hitta bred tillämpning i molekylär diagnos och screening av FXS och bräckliga X-relaterade sjukdomar med mindre turn-around tid och investeringar i utrustning och därmed kan utnyttjas i ett bredare spektrum av kliniska Laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
FXS är den näst vanligaste orsaken till intellektuell försämring efter trisomi 21, som står för nästan hälften av X-bunden mental utvecklingsstörning30, vilket kan påverka cirka 1 av 4 000 män och 1 i 8 000 kvinnor. Ännu viktigare är att nästan 1 av 250 – 1000 honor bär på en premutation, och denna frekvens är 1 på 250 – 1600 hos män26,31,32,33. Ef…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av bidrag från NSFC Emergency Management Project (Grant nr 81741004), National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 81860272), den stora forskningsplanen för Provincial Science and Technology Foundation i Guangxi ( Grant No. AB16380219), China postdoktorala stiftelsen Grant (Grant nr. 2018M630993), och Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
| FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
| FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
| NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Paper towels | |||
| PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
| reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
| S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
| TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |
Riferimenti
- Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
- Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
- Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
- Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
- Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
- Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
- Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
- Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
- Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
- Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
- Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
- Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
- Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
- Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
- Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
- Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
- Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
- Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
- Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d’endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
- Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
- Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
- Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
- Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
- Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
- Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
- Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
- Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
- Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
- Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene–and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
- Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
- Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
- Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
- Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
- Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
- Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
- Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
- Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).
