在免疫缺陷小鼠中表演人类骨骼肌异种移植物
Summary
在传统的实验室模型系统中，复杂的人类疾病对建模可能具有挑战性。在这里，我们描述了一种通过将人类骨骼肌活检移植到免疫缺陷小鼠中来模拟人类肌肉疾病的外科方法。
Abstract
在动物研究中观察到的治疗效果往往不能在临床试验中重新概括。虽然这个问题是多方面的，但造成这种失败的原因之一是实验室模型使用不足。在传统实验室生物体中模拟复杂的人类疾病是具有挑战性的，但是这个问题可以通过研究人类异种移植来规避。我们在这里描述的手术方法允许创建人类骨骼肌异种移植物，可用于模拟肌肉疾病和进行临床前治疗测试。根据机构审查委员会（IRB）批准的协议，从患者身上获取骨骼肌标本，然后移植到NOD-Rag1空IL2rénull （NRG）宿主小鼠中。这些小鼠是移植研究的理想宿主，因为它们无法制造成熟的淋巴细胞，因此无法发展细胞介导和体液适应性免疫反应。宿主小鼠用肌胶麻醉，小鼠前体和外展性长肌被去除。然后，将一块人类肌肉放在空的骨骼隔间中，并缝合到直龙肌的近端和远端肌腱。异种移植的肌肉由小鼠宿主自发血管化并内化，从而产生强健再生的人类肌肉，可以作为临床前研究的模型。
Introduction
据报道，所有进行临床试验的药物开发项目中，只有13.8%是成功的，并导致了1批准的疗法。虽然这个成功率高于先前报道的10.4%，但仍有重大改进的余地。提高临床试验成功率的一个方法是改进临床前研究中使用的实验室模型。美国食品和药物管理局（FDA）要求动物研究在第一阶段临床试验之前显示治疗效果和评估毒性。然而，动物研究和临床试验3之间的治疗结果往往有限。此外，临床前动物研究的需要可能是缺乏公认动物模型的疾病的治疗发展的不可逾越的障碍，而罕见或零星疾病往往就是这种情况。
模拟人类疾病的一种方法是将人体组织移植到免疫缺陷小鼠体内，以产生异种移植物。异种移植模型有三个关键优点：首先，它们可以概括人类疾病中存在的复杂遗传和表观遗传异常，这些异常可能永远无法在其他动物模型中重现。其次，如果患者样本可用，异种移植可用于模拟罕见或零星疾病。第三，异种移植物在一个完整的体内系统中对疾病进行建模。由于这些原因，我们假设治疗效果导致异种移植模型更有可能转化为在患者的试验。人类肿瘤异种移植已经成功地用于开发常见癌症的治疗方法，包括多发性骨髓瘤，以及针对个别患者的个性化治疗4、5、6、 7.
最近，异种移植物已经被用来开发人类肌肉疾病的模型8。在这个模型中，人类肌肉活检标本被移植到免疫缺陷NRG小鼠的后肢，形成异种移植物。移植的人类肌纤维死亡，但异种移植物中的人类肌肉干细胞随后膨胀并分化成新的人类肌纤维，重新填充移植的人类基础层。因此，这些异种移植物中再生的肌纤维完全是人，由小鼠宿主自发地重新血管化并内化。重要的是，移植到小鼠体内的肌肉萎缩症（FSHD）患者肌肉组织重述了人类疾病的主要特征，即DUX4转录因子8的表达。FSHD是由DUX4的过度表达引起的，在正常的肌肉组织中，DUX4在表观遗传上是沉默的9，10。在FSHD异种移植模型中，使用DUX4特异性形态诺治疗已被证明能够成功地抑制DUX4的表达和功能，并且可能是FSHD患者11的潜在治疗选择。这些结果表明，人类肌肉异种移植是模拟人类肌肉疾病和测试小鼠潜在疗法的新方法。在这里，我们详细介绍了在免疫缺陷小鼠中创建人类骨骼肌异种移植物的手术方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
患者衍生的异种移植是模拟肌肉疾病和进行临床前研究的一种创新方法。此处描述的方法创建骨骼肌异种移植是快速、直接和可重现的。单方手术可在15至25分钟内进行，或以双边方式在30至40分钟内进行。双边异种移植可以提供额外的实验灵活性。例如，研究人员可以对一种异种移植物进行局部治疗，另一种作为对照。NRG小鼠在无病原体设施中工作时对手术部位感染具有抗药性;以我们的经验，执?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了肌炎协会和彼得·巴克基金会的支持。我们要感谢张元凡博士分享她在异种移植外科技术方面的专长和培训。
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Riferimenti
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