Exécution des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes
Summary
Les maladies humaines complexes peuvent être difficiles à modéliser dans les systèmes modèles de laboratoire traditionnels. Ici, nous décrivons une approche chirurgicale pour modéliser la maladie de muscle humain par la transplantation des biopsies humaines de muscle squelettique dans les souris immunodéficientes.
Abstract
Les effets de traitement observés dans les études sur les animaux ne sont souvent pas récapitulés dans les essais cliniques. Bien que ce problème soit multiforme, l’une des raisons de cet échec est l’utilisation de modèles de laboratoire inadéquats. Il est difficile de modéliser des maladies humaines complexes dans les organismes de laboratoire traditionnels, mais cette question peut être contournée par l’étude des xénogreffes humaines. La méthode chirurgicale que nous décrivons ici permet la création de xénogreffes musculaires squelettiques humaines, qui peuvent être utilisées pour modéliser les maladies musculaires et pour effectuer des tests thérapeutiques précliniques. En vertu d’un protocole approuvé par la Commission d’examen institutionnel (CISR), des échantillons de muscle squelettique sont acquis auprès de patients, puis transplantés chez des souris hôtes NOD-Rag1nullIL2rMD (NRG). Ces souris sont des hôtes idéaux pour les études de transplantation en raison de leur incapacité à faire des lymphocytes matures et sont donc incapables de développer des réponses immunitaires adaptatives à médiation cellulaire et humoristique. Les souris hôtes sont anesthésiés avec de l’isoflurane, et les muscles de la souris tibialis antérieure et extensor digitorum longus sont enlevés. Un morceau de muscle humain est alors placé dans le compartiment tibial vide et suture aux tendons proximalets et distal du muscle de longus de peroneus. Le muscle xénogreed est spontanément vascularisé et innervé par l’hôte de souris, ayant pour résultat le muscle humain robustement régénéré qui peut servir de modèle pour des études précliniques.
Introduction
Il a été signalé que seulement 13,8 % de tous les programmes de développement de médicaments faisant l’objet d’essais cliniques sont couronnés de succès et mènent à des thérapies approuvées1. Bien que ce taux de réussite soit supérieur aux 10,4 % précédemment déclarés2,il y a encore beaucoup de place à l’amélioration. Une approche pour augmenter le taux de réussite des essais cliniques consiste à améliorer les modèles de laboratoire utilisés dans la recherche préclinique. La Food and Drug Administration (FDA) exige que des études sur les animaux montrent l’efficacité du traitement et évaluent la toxicité avant les essais cliniques de phase 1. Cependant, il y a souvent une concordance limitée dans les résultats du traitement entre les études sur les animaux et les essais cliniques3. En outre, la nécessité d’études précliniques sur les animaux peut constituer un obstacle insurmontable au développement thérapeutique dans les maladies qui n’ont pas de modèle animal accepté, ce qui est souvent le cas pour les maladies rares ou sporadiques.
Une façon de modéliser la maladie humaine est de transplanter des tissus humains dans des souris immunodéficientes pour générer des xénogreffes. Il y a trois avantages principaux aux modèles de xénogreffe : premièrement, ils peuvent récapituler les anomalies génétiques et épigénétiques complexes qui existent dans la maladie humaine qui peuvent ne jamais être reproductibles dans d’autres modèles animaux. Deuxièmement, les xénogreffes peuvent être utilisées pour modéliser des maladies rares ou sporadiques si des échantillons de patients sont disponibles. Troisièmement, les xénogreffes modéliser la maladie dans un système in vivo complet. Pour ces raisons, nous émettons l’hypothèse que les résultats d’efficacité du traitement dans les modèles de xénogreffe sont plus susceptibles de se traduire par des essais chez les patients. Les xénogreffes de tumeur humaine ont déjà été utilisées avec succès pour développer des traitements pour les cancers communs, y compris le myélome multiple, aussi bien que des thérapies personnalisées pour les patients individuels4,5,6, 7.
Récemment, les xénogreffes ont été utilisées pour développer un modèle de maladie musculaire humaine8. Dans ce modèle, des spécimens de biopsie de muscle humain sont transplantés dans les membres postérieurs des souris immunodéficientes de NRG pour former des xénogreffes. Les myofibres humaines transplantées meurent, mais les cellules souches de muscle humain présentes dans le xénogreffe se développent et se différencient par la suite en nouveaux myofibers humains qui repeuplent la lame basale humaine greffée. Par conséquent, les myofibres régénérées dans ces xérogreffes sont entièrement humaines et sont spontanément revascularisées et innervées par l’hôte de souris. Fait important, la dystrophie musculaire fascioscapulohumeral (FSHD) tissu musculaire patient transplanté chez des souris récapitule les caractéristiques clés de la maladie humaine, à savoir l’expression du facteur de transcription DUX4 8. FSHD est causée par la surexpression de DUX4, qui est épigénétiquement réduit au silence dans le tissu musculaire normal9,10. Dans le modèle de xénogreffe de FSHD, le traitement avec un morpholino DUX4-spécifique a été montré pour réprimer avec succès l’expression et la fonction de DUX4, et peut être une option thérapeutique potentielle pour des patients de FSHD11. Ces résultats démontrent que les xénogreffes musculaires humaines sont une nouvelle approche pour modéliser la maladie musculaire humaine et tester des thérapies potentielles chez la souris. Ici, nous décrivons en détail la méthode chirurgicale pour créer des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les xénogreffes dérivées du patient sont une façon novatrice de modéliser les maladies musculaires et de mener des études précliniques. La méthode décrite ici pour créer des xénogreffes de muscle squelettique est rapide, simple, et reproductible. Les chirurgies unilatérales peuvent être effectuées en 15 à 25 minutes, ou bilatéralement en 30 à 40 minutes. Les xénogreffes bilatérales peuvent fournir une flexibilité expérimentale supplémentaire. Par exemple, les chercheurs peuvent effectuer un traiteme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Association Myositis et la Fondation Peter Buck. Nous tenons à remercier le Dr Yuanfan Zhang pour le partage de son expertise et de sa formation dans la technique chirurgicale de xénogreffe.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
Riferimenti
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