Presenteras här är ett optimerat protokoll för att isolera, odling, transfecting, och differentiera mänskliga primära monocyter från HIV-infekterade individer och friska kontroller.
Humant immunbristvirus (HIV) är fortfarande ett stort hälsoproblem trots införandet av kombinerad antiretroviral behandling (cART) i mitten av 1990-talet. Medan antiretroviral behandling effektivt sänker systemisk virusbelastning och återställer normala CD4+ T-celler räknas, det inte rekonstituerar ett helt funktionellt immunförsvar. Ett dysfunktionellt immunsystem i HIV-infekterade individer som genomgår cART kan kännetecknas av immunförsvaret aktivering, tidigt åldrande av immunceller, eller ihållande inflammation. Dessa villkor, tillsammans med comorbida faktorer förknippade med HIV-infektion, lägga komplexitet till sjukdomen, som inte lätt kan återges i cellulära och djurmodeller. För att undersöka molekylära händelser underliggande immun dysfunktion hos dessa patienter, ett system för att kultur och manipulera mänskliga primära monocyter in vitro presenteras här. Specifikt tillåter protokollet för kulturen och transfektion av primära CD14+ monocyter som erhållits från hiv-infekterade personer som genomgår cART samt från hiv-negativa kontroller. Metoden innebär isolering, kultur, och transfektion av monocyter och monocyte-härledda makrofager. Medan kommersiellt tillgängliga kit och reagens används, ger protokollet viktiga tips och optimerade förutsättningar för framgångsrik följsamhet och transfektion av monocyter med Mirna härmar och hämmare samt med sirnas.
Humant immunbristvirus-1 (HIV-1) infektion orsakar svår immun dysfunktion, vilket kan leda till opportunistiska infektioner och förvärvade immunbristsyndrom (AIDS). Även om HIV-infekterade patienter som genomgår cART kännetecknas av låg virusbelastning och normala CD4+ T-celler räknas, kan funktionen hos immunförsvaret äventyras hos dessa individer, vilket leder till en dysfunktionell immunsvar som har kopplats till en ökad risk att utveckla cancer1. Mekanismerna för immun dysfunktion hos HIV-patienter i cART är fortfarande i stort sett okända. Därför är att karakterisera patient-derived immunceller och undersöka deras biologi och funktion är en kritisk komponent i nuvarande HIV-forskning.
Monocyter och makrofager är viktiga regulatorer av immunsvar och spela grundläggande roller i hiv-infektion2,3,4,5. Heterogena och plast i naturen, makrofager kan grovt klassificeras i klassiskt aktiverad (M1) eller alternativt aktiverad (m2). Även om denna allmänna klassificering är nödvändig när man ställer upp experimentella tillstånd, kan polarisation status av makrofager vändas genom en mängd olika cytokiner6,7,8,9. Även om flera studier har undersökt effekterna av hiv-infektion på monocyter och dendritiska celler, molekylära detaljer i monocyte-medierade svar är i stort sett okända6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Bland de faktorer som är involverade i immun cells reglering och funktion, microRNAs (miRNAs), korta icke-kodning RNAs att post-transkriptionellt reglera genuttryck, har visat sig spela en viktig roll i samband med stora cellulära vägar (dvs. tillväxt, differentiering, utveckling, och apoptos)20. Dessa molekyler har beskrivits som viktiga regulatorer av transkriptionsfaktorer avgörande för diktera funktionell polarisering av makrofager21. Den potentiella roll mirnas i monocyter från hiv-infekterade personer som genomgår cART har undersökts, men framsteg inom området kräver mycket mer arbete22,23,24,25,26. Denna uppsats diskuterar en optimerad metod för att transfect miRNAs och siRNAs i primära humana monocyter från HIV-infekterade patienter och kontroller.
Detta protokoll bygger på kommersiellt tillgängliga reagenser och byggsatser, eftersom kontinuiteten i det tekniska förfarandet hjälper till att eliminera onödiga experimentella variabler vid arbete med kliniska prover. Icke desto mindre, metoden ger viktiga tips (dvs, antalet celler pläterad eller kort inkubation med serum-fria medier för att främja efterlevnaden av celler till plattan). Dessutom kommer de polariserings förhållanden som används i detta protokoll att härledas från publicerat arbete27,28,29.
Det presenterade protokollet visar användningen av primära celler från HIV-infekterade försökspersoner som en modell för att studera monocyter och makrofager. HIV+ patienter som genomgår cART lever med infektion i flera år och kan också ha andra co-infektioner relaterade ett nedsatt immunförsvar. För att studera Immunomodulering i närvaro av HIV-kronisk infektion, celler skördats från patienter direkt. Som miRNAs har visat sig spela stora roller i cell utveckling och differentiering, fokuserar pr…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka HIV Clinical/tumör Biorepository kärna för att tillhandahålla patientprover och cellulära immunologi metabolism kärna för att tillhandahålla flödescytometri analys. Projektet finansierades av NIH P20GM121288 och P30GM114732.
0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
PBS | Gibco | 20012027 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |