यहां प्रस्तुत एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों और स्वस्थ नियंत्रणों से मानव प्राथमिक मोनोसाइट्स को अलग करने, संजोने, अलग करने और अंतर करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है।
मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) 1990 के दशक के मध्य में संयुक्त एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (cART) की शुरुआत के बावजूद एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता का विषय बना हुआ है । जबकि एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी कुशलता से प्रणालीगत वायरल लोड को कम करती है और सामान्य सीडी 4+ टी सेल की गिनती को पुनर्स्थापित करती है, यह पूरी तरह से कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली का पुनर्गठन नहीं करती है। एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों में एक बेकार प्रतिरक्षा प्रणाली कैआरटी से गुजर रही प्रतिरक्षा सक्रियण, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जल्दी उम्र बढ़ने, या लगातार सूजन की विशेषता हो सकती है। एचआईवी संक्रमण से जुड़े कोमोर्बिड कारकों के साथ-साथ ये स्थितियां इस बीमारी में जटिलता जोड़ती हैं, जिसे सेलुलर और पशु मॉडल में आसानी से पुन: पेश नहीं किया जा सकता है। इन रोगियों में प्रतिरक्षा रोग अंतर्निहित आणविक घटनाओं की जांच करने के लिए, विट्रो में मानव प्राथमिक मोनोसाइट्स को संस्कृति और हेरफेर करने के लिए एक प्रणाली यहां प्रस्तुत की जाती है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों से प्राप्त प्राथमिक CD14+ मोनोसाइट्स की संस्कृति और ट्रांसफेक्शन के साथ-साथ एचआईवी-नकारात्मक नियंत्रणों से अनुमति देता है। विधि में मोनोसाइट्स और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का अलगाव, संस्कृति और ट्रांसफेक्शन शामिल है। जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट और अभिकर्मक ों को नियोजित किया जाता है, प्रोटोकॉल मिरना नकल और अवरोधकों के साथ-साथ सिनाके के साथ मोनोसाइट्स के सफल पालन और ट्रांसफेक्शन के लिए महत्वपूर्ण सुझाव और अनुकूलित स्थितियां प्रदान करता है।
ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस-1 (एचआईवी-1) संक्रमण गंभीर प्रतिरक्षा रोग का कारण बनता है, जो अवसरवादी संक्रमण का कारण बन सकता है और इम्यूनोडेफिशिएंसी सिंड्रोम (एड्स) का अधिग्रहण कर सकता है। हालांकि एचआईवी संक्रमित cART के दौर से गुजर रोगियों को कम वायरल भार और सामांय CD4+ टी सेल मायने रखता है की विशेषता है, प्रतिरक्षा प्रणाली के कामकाज इन व्यक्तियों में समझौता किया जा सकता है, एक बेकार प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि कैंसर के विकास के एक बढ़े हुए जोखिम से जोड़ा गया है के लिए अग्रणी1। CART पर एचआईवी रोगियों में प्रतिरक्षा रोग के तंत्र काफी हद तक अज्ञात रहते हैं । इसलिए, रोगी-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशेषता और उनके जीव विज्ञान और कार्य की जांच वर्तमान एचआईवी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण घटक है।
मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रमुख नियामक हैं और एचआईवी संक्रमण2,3,4,5में मौलिक भूमिका निभाते हैं । विषम और प्रकृति में प्लास्टिक, मैक्रोफेज को मोटे तौर पर शास्त्रीय रूप से सक्रिय (एम 1) या वैकल्पिक रूप से सक्रिय (एम 2) में वर्गीकृत किया जा सकता है। हालांकि प्रायोगिक स्थितियों की स्थापना करते समय यह सामान्य वर्गीकरण आवश्यक है, लेकिन मैक्रोफेज की ध्रुवीकरण की स्थिति को विभिन्न प्रकार के साइटोकिन्स6,7,8,9से उलट दिया जा सकता है। यद्यपि कई अध्ययनों ने मोनोसाइट्स और डेंड्रिटिक कोशिकाओं पर एचआईवी संक्रमण के प्रभावों की जांच की है, लेकिन मोनोसाइट-मध्यस्थता वाली प्रतिक्रियाओं का आणविक विवरण काफी हद तक अज्ञात6,7,10, 11,12,13,14,15,16, 17,18,19है । प्रतिरक्षा सेल विनियमन और कार्य में शामिल कारकों में, माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए), शॉर्ट नॉन-कोडिंग आरएनए जो पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनी जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं, को प्रमुख सेलुलर रास्तों (यानी विकास, भेदभाव, विकास और एपोप्टोसिस)20के संदर्भ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। इन अणुओं को मैक्रोफेज21के कार्यात्मक ध्रुवीकरण को हुक्म देने के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारकों के महत्वपूर्ण नियामक ों के रूप में वर्णित किया गया है । एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों से मोनोसाइट्स में miRNAs की संभावित भूमिका की जांच की गई है,लेकिन इस क्षेत्र में प्रगति के लिए22,23,24,25,26अधिक काम की आवश्यकता है । यह पत्र एचआईवी संक्रमित रोगियों और नियंत्रणों से प्राथमिक मानव मोनोसाइट्स में मिरना और सिनास को स्थानांतरित करने के लिए एक अनुकूलित विधि पर चर्चा करता है।
यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और किट ों पर निर्भर करता है, क्योंकि तकनीकी प्रक्रिया में निरंतरता नैदानिक नमूनों के साथ काम करते समय अनावश्यक प्रयोगात्मक चर को खत्म करने में मदद करती है। फिर भी, विधि महत्वपूर्ण सुझाव प्रदान करता है (यानी, प्लेट के लिए कोशिकाओं के पालन को बढ़ावा देने के लिए सीरम मुक्त मीडिया के साथ चढ़ाया या संक्षिप्त ऊष्मायन कोशिकाओं की संख्या) । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली ध्रुवीकरण की स्थितियांप्रकाशित कार्य27,28,29से प्राप्त होती हैं।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में एचआईवी संक्रमित विषयों से प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग को दर्शाता है । एचआईवी+ cART के दौर से गुजर रोगियों को कई वर्ष…
The authors have nothing to disclose.
लेखक रोगी के नमूने और सेलुलर इम्यूनोलॉजी मेटाबोलिज्म कोर को फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण प्रदान करने के लिए एचआईवी नैदानिक/ट्यूमर बायोरेपोसिटररी कोर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस परियोजना को एनआईएच पी20जीएम 121288 और पी30GM114732 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
PBS | Gibco | 20012027 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |