Isolering, transfektion och kultur av primära mänskliga monocyter
Summary
Presenteras här är ett optimerat protokoll för att isolera, odling, transfecting, och differentiera mänskliga primära monocyter från HIV-infekterade individer och friska kontroller.
Abstract
Humant immunbristvirus (HIV) är fortfarande ett stort hälsoproblem trots införandet av kombinerad antiretroviral behandling (cART) i mitten av 1990-talet. Medan antiretroviral behandling effektivt sänker systemisk virusbelastning och återställer normala CD4+ T-celler räknas, det inte rekonstituerar ett helt funktionellt immunförsvar. Ett dysfunktionellt immunsystem i HIV-infekterade individer som genomgår cART kan kännetecknas av immunförsvaret aktivering, tidigt åldrande av immunceller, eller ihållande inflammation. Dessa villkor, tillsammans med comorbida faktorer förknippade med HIV-infektion, lägga komplexitet till sjukdomen, som inte lätt kan återges i cellulära och djurmodeller. För att undersöka molekylära händelser underliggande immun dysfunktion hos dessa patienter, ett system för att kultur och manipulera mänskliga primära monocyter in vitro presenteras här. Specifikt tillåter protokollet för kulturen och transfektion av primära CD14+ monocyter som erhållits från hiv-infekterade personer som genomgår cART samt från hiv-negativa kontroller. Metoden innebär isolering, kultur, och transfektion av monocyter och monocyte-härledda makrofager. Medan kommersiellt tillgängliga kit och reagens används, ger protokollet viktiga tips och optimerade förutsättningar för framgångsrik följsamhet och transfektion av monocyter med Mirna härmar och hämmare samt med sirnas.
Introduction
Humant immunbristvirus-1 (HIV-1) infektion orsakar svår immun dysfunktion, vilket kan leda till opportunistiska infektioner och förvärvade immunbristsyndrom (AIDS). Även om HIV-infekterade patienter som genomgår cART kännetecknas av låg virusbelastning och normala CD4+ T-celler räknas, kan funktionen hos immunförsvaret äventyras hos dessa individer, vilket leder till en dysfunktionell immunsvar som har kopplats till en ökad risk att utveckla cancer1. Mekanismerna för immun dysfunktion hos HIV-patienter i cART är fortfarande i stort sett okända. Därför är att karakterisera patient-derived immunceller och undersöka deras biologi och funktion är en kritisk komponent i nuvarande HIV-forskning.
Monocyter och makrofager är viktiga regulatorer av immunsvar och spela grundläggande roller i hiv-infektion2,3,4,5. Heterogena och plast i naturen, makrofager kan grovt klassificeras i klassiskt aktiverad (M1) eller alternativt aktiverad (m2). Även om denna allmänna klassificering är nödvändig när man ställer upp experimentella tillstånd, kan polarisation status av makrofager vändas genom en mängd olika cytokiner6,7,8,9. Även om flera studier har undersökt effekterna av hiv-infektion på monocyter och dendritiska celler, molekylära detaljer i monocyte-medierade svar är i stort sett okända6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Bland de faktorer som är involverade i immun cells reglering och funktion, microRNAs (miRNAs), korta icke-kodning RNAs att post-transkriptionellt reglera genuttryck, har visat sig spela en viktig roll i samband med stora cellulära vägar (dvs. tillväxt, differentiering, utveckling, och apoptos)20. Dessa molekyler har beskrivits som viktiga regulatorer av transkriptionsfaktorer avgörande för diktera funktionell polarisering av makrofager21. Den potentiella roll mirnas i monocyter från hiv-infekterade personer som genomgår cART har undersökts, men framsteg inom området kräver mycket mer arbete22,23,24,25,26. Denna uppsats diskuterar en optimerad metod för att transfect miRNAs och siRNAs i primära humana monocyter från HIV-infekterade patienter och kontroller.
Detta protokoll bygger på kommersiellt tillgängliga reagenser och byggsatser, eftersom kontinuiteten i det tekniska förfarandet hjälper till att eliminera onödiga experimentella variabler vid arbete med kliniska prover. Icke desto mindre, metoden ger viktiga tips (dvs, antalet celler pläterad eller kort inkubation med serum-fria medier för att främja efterlevnaden av celler till plattan). Dessutom kommer de polariserings förhållanden som används i detta protokoll att härledas från publicerat arbete27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet visar användningen av primära celler från HIV-infekterade försökspersoner som en modell för att studera monocyter och makrofager. HIV+ patienter som genomgår cART lever med infektion i flera år och kan också ha andra co-infektioner relaterade ett nedsatt immunförsvar. För att studera Immunomodulering i närvaro av HIV-kronisk infektion, celler skördats från patienter direkt. Som miRNAs har visat sig spela stora roller i cell utveckling och differentiering, fokuserar pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka HIV Clinical/tumör Biorepository kärna för att tillhandahålla patientprover och cellulära immunologi metabolism kärna för att tillhandahålla flödescytometri analys. Projektet finansierades av NIH P20GM121288 och P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
Riferimenti
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Ricerca sul cancro. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
