Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie
Summary
De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.
Abstract
De gepresenteerde methode of licht gewijzigde versies zijn bedacht om specifieke behandelings responsen en bijwerkingen van verschillende anti-kankerbehandelingen te bestuderen, zoals gebruikt in de klinische oncologie. Het maakt een kwantitatieve en longitudinale analyse van de DNA-schade reactie mogelijk na genotoxische stress, zoals geïnduceerd door radiotherapie en een veelheid aan anti-kanker drugs. De methode dekt alle stadia van de DNA-schade reactie, het verstrekken van eindpunten voor inductie en reparatie van DNA dubbel strand Breaks (DSBs), arrestatie van de celcyclus en celdood door Apoptosis in geval van herstel falen. Het combineren van deze metingen geeft informatie over de celcyclus afhankelijke behandelingseffecten en maakt zo een grondige studie mogelijk van de wisselwerking tussen cellulaire proliferatie en het omgaan met DNA-beschadiging. Aangezien het effect van veel kankertherapieën, waaronder chemotherapeutische middelen en ioniserende straling, beperkt is tot of sterk varieert naargelang de specifieke celcyclus fasen, vertrouwen correlatieve analyses op een robuuste en haalbare methode om de behandelingseffecten te beoordelen op het DNA in een celcyclus-specifieke manier. Dit is niet mogelijk met assays met één eindpunt en een belangrijk voordeel van de gepresenteerde methode. De methode is niet beperkt tot een bepaalde cellijn en is grondig getest in een veelheid van tumor en normale weefsel cellijnen. Het kan op grote schaal worden toegepast als een uitgebreide genotoxiciteitstest op vele gebieden van oncologie naast radio-oncologie, waaronder milieueffectbeoordeling, geneesmiddelen screening en evaluatie van genetische instabiliteit in tumorcellen.
Introduction
Het doel van oncologie is om kankercellen te doden of te deactiveren zonder de normale cellen te schaden. Veel therapieën induceren direct of indirect genotoxische stress in kankercellen, maar ook bij sommige zich uitstrekken in normale cellen. Chemotherapie of gerichte geneesmiddelen worden vaak gecombineerd met radiotherapie om de radio gevoeligheid van de bestraalde tumor1,2,3,4,5te verbeteren, wat een reductie van de stralingsdosis om normale weefselbeschadiging te minimaliseren.
Ioniserende straling en andere genotoxische middelen induceren verschillende soorten DNA-schade, waaronder basis modificaties, strand verknopingen en enkel-of dubbel strand pauzes. DNA Double-strand Breaks (DSBs) zijn de ernstigste DNA laesies en hun inductie is de sleutel tot het celdodende effect van ioniserende straling en diverse cytostatica in radio chemotherapie. Dsbs schaden niet alleen de integriteit van het genoom, maar bevorderen ook de vorming van mutaties op6,7. Daarom hebben verschillende DSB-reparatie trajecten en mechanismen om onherstelbaar beschadigde cellen zoals apoptosis te elimineren tijdens de evolutie ontwikkeld. De gehele DNA-schade respons (DDR) wordt gereguleerd door een complex netwerk van signalerings trajecten die reiken van DNA-schade herkenning en celcyclus arrestatie om DNA-herstel mogelijk te maken, tot geprogrammeerde celdood of inactivatie in geval van reparatie storing8.
De gepresenteerde Flow-cytometrische methode is ontwikkeld om de DDR na genotoxische stress te onderzoeken in een uitgebreide test die de inductie en reparatie van DSB dekt, evenals de gevolgen van herstel fouten. Het combineert de meting van de veeltoegepaste DSB marker γH2AX met analyse van de celcyclus en inductie van apoptosis, met behulp van klassieke subG1 analyse en specifiekere evaluatie van caspase-3 activering.
De combinatie van deze eindpunten in één assay vermindert niet alleen de tijd, arbeid en kosten uitgaven, maar maakt ook de celcyclus-specifieke meting van DSB inductie en reparatie, evenals caspase-3 activering. Dergelijke analyses zijn niet mogelijk met onafhankelijk uitgevoerde testen, maar ze zijn zeer relevant voor een uitgebreid begrip van de DNA-schade respons na genotoxische stress. Veel anti-kanker drugs, zoals cytostatische verbindingen, zijn gericht tegen het verdelen van cellen en hun efficiëntie is sterk afhankelijk van de fase van de celcyclus. De beschikbaarheid van verschillende DSB reparatie processen is ook afhankelijk van de celcyclus fase en traject keuze die essentieel is voor de reparatie nauwkeurigheid, en op zijn beurt bepaalt het lot van de cel9,10,11, 12. Bovendien is celcycle-specifieke meting van DSB-niveaus nauwkeuriger dan gepoolde analyse, omdat DSB-niveaus niet alleen afhankelijk zijn van de dosis van een genotoxische verbinding of straling, maar ook van het DNA-gehalte van de cel.
De methode is gebruikt om de werkzaamheid van verschillende radio therapieën te vergelijken om de resistentiemechanismen in multiform glioblastoom13 te overwinnen en het samenspel tussen ioniserende straling en gerichte geneesmiddelen in Osteosarcoom te ontleden14,15 en atypische teratoïde rhabdoïde kankers16. Bovendien is de beschreven methode op grote schaal gebruikt voor het analyseren van bijwerkingen van radio-en chemotherapie op mesenchymale stamcellen17,18,19,20,21, 22,23,24, die essentieel zijn voor de reparatie van de behandeling veroorzaakte normale weefselbeschadiging en een mogelijke toepassing in regeneratieve geneeskunde.
Protocol
Representative Results
Discussion
De aanbevolen methode is eenvoudig te gebruiken en biedt een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare meting van de DNA-schade respons inclusief dubbele-strand break (DSB) inductie en reparatie, celcyclus effecten en apoptotische celdood. De combinatie van deze eindpunten biedt een vollediger beeld van hun onderlinge relaties dan individuele assays. De methode kan op grote schaal worden toegepast als een uitgebreide genotoxiciteitstest op het gebied van stralings biologie, therapie en bescherming, en meer in het algemeen i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken het flow Cytometry Facility team van het Duitse kanker onderzoekscentrum (DKFZ) voor hun steun.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
Riferimenti
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
