Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA
Summary
Gli RNA circolari (circRNA) sono RNA non codificanti che possono avere ruoli nella regolazione trascrizionale e nelle interazioni di mediazione tra proteine. A seguito della valutazione di diversi parametri per la costruzione di librerie di sequenziamento di circuitRNA, è stato compilato un protocollo che utilizza la preparazione della libreria totale di RNA spiaggiata con il pretrattamento di RNase R ed è presentato qui.
Abstract
Gli RNA circolari (circRNA) sono una classe di RNA non codificanti coinvolti in funzioni tra cui la regolazione del microRNA (miRNA), la mediazione delle interazioni proteina-proteina e la regolazione della trascrizione genica parentale. Nel sequenziamento dell’RNA di nuova generazione (RNA-seq) classico, i circolrRNA sono tipicamente trascurati come risultato della selezione poli-A durante la costruzione di librerie di mRNA, o si trovano a un’abbondanza molto bassa e sono quindi difficili da isolare e rilevare. In questo caso, un protocollo di costruzione della libreria di circRNA è stato ottimizzato confrontando kit di preparazione della libreria, opzioni di pretrattamento e varie quantità totali di ingresso di RNA. Sono stati testati due kit di preparazione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza RNase R pre-trattamento, e utilizzando quantità variabili di ingresso totale di RNA (da 1 a 4 g). Infine, più tipi di tessuto; tra cui fegato, polmone, linfonodo e pancreas; così come più regioni cerebrali; tra cui il cervelletto, il lobo parietale inferiore, il giro temporale medio, la corteccia occipitale e il giro frontale superiore; sono stati confrontati per valutare l’abbondanza di circRNA tra i tipi di tessuto. L’analisi dei dati generati in RNA-seq utilizzando sei diversi strumenti di rilevamento degli RNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) ha rivelato che un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilato con pretrattamento RNase R e 4 g di ingresso in RNA è l’ottimale per identificare il numero relativo più elevato di circRNA. Coerentemente con i risultati precedenti, il più alto arricchimento dei circRNA è stato osservato nei tessuti cerebrali rispetto ad altri tipi di tessuti.
Introduction
Gli RNA circolari (CircRNA) sono RNA endogeni e non codificanti che hanno guadagnato attenzione data la loro espressione pervasiva nel trascrittoma eucarotico1,2,3. Si formano quando gli esoni si ricongiungino l’uno con l’altro e quindi sono stati inizialmente considerati artefatti di giunzione4,5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che i circRNA presentano il tipo di cellula, il tessuto e l’espressione specifica dello stadio di sviluppo3,6 e sono evolutivamente conservati2,3. Inoltre, sono coinvolti nella mediazione delle interazioni proteina7, microRNA (miRNA) legame3,8,9,10, e la regolazione della trascrizione genica parentale11.
Nel sequenziamento dell’RNA classico (RNA-seq), i circRNA possono essere completamente persi durante la costruzione della biblioteca a causa della selezione poli-A per gli mRNA o possono essere difficili da isolare data la loro bassa abbondanza. Tuttavia, recenti studi di caratterizzazione degli anni ‘rcRNA hanno incorporato una fase di pre-trattamento utilizzando RNase R al fine di arricchire per i circRNA2,12,13. RNase R è un exoribonucleolaga che digerisce gli RNA lineari, lasciando dietro di sé strutture circolari di RNA. I protocolli di arricchimento di CircRNA sono stati ottimizzati generando e confrontando i dati di due kit di costruzione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza una fase di pretrattamento di RNase R, e utilizzando quantità variabili di input totale di RNA (da 1 a 4 g). Il protocollo ottimizzato è stato successivamente utilizzato per valutare l’abbondanza di circRNA in cinque diverse regioni del cervello (cervelletto [BC], lobo parietale inferiore [IP], giro temporale medio [MG], corteccia occipitale [OC] e giro frontale superiore [SF]) e altri quattro tipi di tessuto (fegato [LV], polmone [LU], nodo linfoficio [LN]). Le librerie RNA-seq sono state accoppiate fine sequenziate e i dati sono stati analizzati utilizzando sei diversi algoritmi di previsione di circRNA: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17e CIRCexplorer18. Sulla base della nostra analisi, il numero più alto di circRNA unici è stato rilevato quando si utilizza un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilata con pre-trattamento RNase R e 4 RNA di input totale. Il protocollo ottimizzato è descritto qui. Come riportato in precedenza19,20, il più alto arricchimento di circRNA è stato osservato nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio sono stati testati due kit di preparazione della libreria disponibili in commercio, opzioni di pre-trattamento e quantità di RNA di input al fine di ottimizzare un protocollo di arricchimento del circRNA per la costruzione di librerie di sequenziamento del circRNA. Sulla base delle valutazioni di questo studio, sono evidenti una serie di aspetti chiave e passaggi critici nella creazione di librerie di sequenziamento degli xml circolr. La nostra valutazione conferma l’utilità del pretrattamento di RNase…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) di Sun City, Arizona, per la fornitura di tessuti cerebrali umani. Il BBDP è stato supportato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson’s Disease and Related Disorders), il National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona’s Disease Core Center), l’Arizona Department of Health Services (contratto 211002, Arizona Alzheimer’s Research Center), Arizona Biomedical Research Commission (contratti 4001, 0011, 05-901 e 1001 per l’Arizona Parkinson’s Disease Consortium) e il Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research27. Questo studio è stato sostenuto anche dal DHS e dallo Stato dell’Arizona (ADHS grant – ADHS14-052688). Ringraziamo anche Andrea Schmitt (Banner Research) e Cynthia Lechuga (TGen) per il supporto amministrativo.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
Riferimenti
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