Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von antigenspezifischen CD8-T-Zellen und deren Ausdehnung in vitro mit dem Ziel, eine hohe Anzahl funktioneller T-Zellen für den Einsatz in vitro und in vivo zu liefern.
Abstract
Typ-1-Diabetes (T1D) zeichnet sich durch eine isletspezifische Autoimmunität aus, die zur Betazellzerstörung und zum absoluten Verlust der Insulinproduktion führt. Im spontanen nicht-fettleibigen Diabetes -Mausmodell ist Insulin das primäre Ziel, und die genetische Manipulation dieser Tiere zur Entfernung eines einzigen Schlüsselinsulinepitops verhindert Krankheiten. Daher ist die selektive Eliminierung professioneller Antigen-präsentierender Zellen (APCs), die dieses pathogene Epitop tragen, ein Ansatz, um die unerwünschten insulinspezifischen Autoimmunreaktionen zu hemmen, und hat wahrscheinlich ein größeres translationales Potenzial.
Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) können T-Zellen selektiv auf krankheitserregende Antigene umleiten. Diese Technik ist von grundlegender Bedeutung für die jüngsten Versuche, Zelltechnik für die Adoptivzelltherapie zur Behandlung mehrerer Krebsarten zu verwenden. In diesem Protokoll beschreiben wir ein optimiertes T-Zell-Retrovirus (RV)-Transduktions- und In-vitro-Erweiterungsprotokoll, das eine hohe Anzahl funktioneller antigenspezifischer CD8-CAR-T-Zellen aus einer geringen Anzahl naiver Zellen erzeugt. Zuvor wurden mehrere CAR-T-Zellprotokolle beschrieben, in der Regel jedoch mit relativ geringer Transduktionseffizienz und Zelllebensfähigkeit nach Derduktion. Im Gegensatz dazu bietet unser Protokoll eine Transduktionseffizienz von bis zu 90 %, und die erzeugten Zellen können mehr als zwei Wochen in vivo überleben und den Krankheitsbeginn nach einer einzigen Infusion erheblich verzögern. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung des Zellwartungs- und Transduktionsprotokolls, so dass die kritischen Schritte leicht befolgt werden können. Die gesamte Prozedur von der primären Zellisolation bis zum CAR-Ausdruck kann innerhalb von 14 Tagen durchgeführt werden. Die allgemeine Methode kann auf jedes Mauskrankheitsmodell angewendet werden, in dem das Ziel bekannt ist. In ähnlicher Weise ist die spezifische Anwendung (die auf einen pathogenen Peptid/MHC-Klasse-II-Komplex abzielt) auf jedes andere Modell von Autoimmunerkrankungen anwendbar, für das ein Schlüsselkomplex identifiziert wurde.
Introduction
Angesichts des wahrscheinlich reduzierten Risikos unerwünschter Off-Target-Effekte sind antigenspezifische Immuntherapien (ASI) vielversprechende Behandlungen für Autoimmunerkrankungen wie T1D. Anhäufende Hinweise deuten darauf hin, dass Immunantworten auf (Prepro)Insulin bei T1D1besonders wichtig sein können. In den letzten zehn Jahren deuten Studien aus mehreren Gruppen, einschließlich unserer eigenen, stark darauf hin, dass die Darstellung eines Epitops, das Insulin-B-Kettenaminosäuren 9 bis 23 durch spezifische MHC-Klasse-II-Moleküle (B:9-23/MHCII) enthält, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von T1D bei Mäuse und Menschen2,3,4,5. Um den B:9-23/MHCII-Komplex gezielt ins Visier zu nehmen, haben wir einen monoklonalen Antikörper namens mAb287 entwickelt, der keine Kreuzreaktivität gegenüber dem Hormon Insulin oder Komplexen hat, die andere Peptide enthalten6. MAb287 blockiert die Antigen-Präsentation in vitro und die wöchentliche Verabreichung von mAb287 an prädiabetische NOD-Mäuse verzögerte die Entwicklung von T1D bei 35% der behandelten Mäuse6. Um die Antigen-Präsentation in vivo zu blockieren, sind in der Regel häufige Injektionen erforderlich, um eine hohe zirkulierende Konzentration aufrechtzuerhalten. Wir vermuteten, dass wir diese Schwierigkeit überwinden könnten, indem wir die hohe Spezifität von Ab287 nutzen, um T-Zellen neu zu programmieren, wodurch eine verbesserte antigenspezifische T-Zell-Therapie für T1D7zur Verfügung gestellt wird.
Zytotoxische T-Zellen sollen ihr Ziel töten können, wenn sogar eine einzigeKopie ihres Cognate-Ligands 8,9,10ausgedrückt wird. Daher wird erwartet, dass B:9-23/MHCII-spezifische CD8-T-Zellen eine höhere Effizienz bei der Beseitigung der unerwünschten Antigen-Präsentation aufweisen als der mutterliche Antikörper, der wahrscheinlich an mehrere Komplexe auf demselben APC binden muss, um seine Wirkung auszuüben. CAR T-Zellen wurden zur Behandlung mehrerer menschlicher Krebsarten11,12,13, und kann auch wirksam in Autoimmunität14sein. Car-T-Zellen mit Spezifität für pathogene Peptid-MHC-Komplexe wurden jedoch bisher nicht verwendet, um das Fortschreiten von T1D zu verändern. Mit der unten beschriebenen optimierten CD8 T-Zelltransduktionstechnik haben wir vor kurzem den Grundsatz beweisnachweis erbracht, dass dies tatsächlich einen praktikablen Ansatz darstellt7.
In diesem Protokoll skizzieren wir eine effiziente und schlanke Transduktions- und Expansionsmethode. Unser Protokoll gilt für andere Studien, die die Erzeugung von Maus-CD8 CAR T-Zellen mit hoher Effizienz erfordern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Herstellung antigenspezifischer CD8 CAR-T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Die Transduktionseffizienz unseres Protokolls ist in der Regel hoch, und eine robuste Expression der CAR wird im Allgemeinen beobachtet. Die erweiterten CAR-T-Zellen behalten die wesentlichen Merkmale der elternaktivierten T-Zellen und die Antikörperspezifität bei und sind sowohl für den In-vitro- als auch für den In-vivo-Einsatz geeignet. Wir haben Ab-CAR CD8 T-Zellen bei der Neupr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch JDRF-Stipendien 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B und SRA-2-S-2018-648-S-B, einen Diabetes Education and Action Award, und den Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine am Baylor College of Medicine. Die Zellsortierung wurde vom Cytometrie- und Zellsortierungskern am Baylor College of Medicine mit Mitteln des NIH (S10RR024574 und P30CA125123) unterstützt. Alle Peptid-MHC-Tetramere wurden aus der NIH Tetramer Core Facility gewonnen.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
Riferimenti
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