Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.
Abstract
Type 1 diabetes (T1D) wordt gekenmerkt door de eilandje-specifieke auto-immuniteit leidt tot bèta celvernietiging en absoluut verlies van insulineproductie. In het spontane niet-zwaarlijvige diabetes (NOD) muismodel, insuline is het primaire doelwit, en genetische manipulatie van deze dieren te verwijderen van een enkele sleutel insuline epitoop voorkomt ziekte. Dus selectieve eliminatie van professionele antigeen presentatie cellen (apc’s) die deze pathogene epitoop dragen, is een benadering om de ongewenste insuline-specifieke auto-immuunresponsen te remmen en heeft waarschijnlijk een groter translationeel potentieel.
Chimeric antigeen receptoren (Auto’s) kunnen T cellen omleiden naar selectief richten op ziekteveroorzakende antigenen. Deze techniek is van fundamenteel belang voor recente pogingen om cellulaire techniek te gebruiken voor adoptie van celtherapie om meerdere kankers te behandelen. In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde T-Cell retrovirus (RV) transductie en in-vitro uitbreidings protocol dat hoge aantallen functionele antigeen-specifieke CD8 CAR-T cellen genereert, beginnend bij een laag aantal naïeve cellen. Eerder werden meerdere auto-T-celprotocollen beschreven, maar meestal met relatief lage transductie-efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen na transductie. Ons protocol biedt daarentegen tot 90% transductie-efficiëntie en de gegenereerde cellen kunnen meer dan twee weken in vivo overleven en het begin van de ziekte significant vertragen na een enkelvoudige infusie. We geven een gedetailleerde beschrijving van het celonderhoud en het transductie protocol, zodat de kritische stappen gemakkelijk kunnen worden opgevolgd. De hele procedure van het isoleren van de primaire cel tot de auto-expressie kan binnen 14 dagen worden uitgevoerd. De algemene methode kan worden toegepast op elke muis ziekte model waarin het doel bekend is. Evenzo is de specifieke toepassing (gericht op een pathogene peptide/MHC klasse II complex) van toepassing op elk ander auto-immuunziekte model waarvoor een sleutel complex is geïdentificeerd.
Introduction
Gezien het waarschijnlijke verminderde risico op ongewenste niet-doel effecten, zijn antigeen-specifieke immuuntherapieën (ASI) veelbelovende behandelingen voor auto-immuunziekten zoals T1D. Accumulerend bewijs suggereert dat immuunresponsen op (PrePro) insuline bijzonder belangrijk kan zijn in T1D1. In het afgelopen decennium, studies van meerdere groepen, met inbegrip van onze eigen, sterk suggereren dat de presentatie van een epitoop met insuline B keten aminozuren 9 aan 23 door specifieke MHC klasse II moleculen (B: 9-23/mhcii), speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van T1D in muizen en mensen2,3,4,5. Selectief richten op de B: 9-23/MHCII complex, we genereerden een monoklonaal antilichaam, genaamd mAb287, dat heeft geen kruisreactiviteit aan het hormoon insuline of complexen met andere peptiden6. MAb287 blocks antigeen presentatie in vitro, en wekelijkse toediening van mAb287 aan pre-diabetische NOD muizen vertraagde de ontwikkeling van T1D in 35% van de behandelde muizen6. Om de antigeen-presentatie in vivo te blokkeren, zijn frequente injecties meestal nodig om een hoge circulerende concentratie te behouden. We veronderstelde dat we deze moeilijkheid kunnen overwinnen door gebruik te maken van de hoge specificiteit van Ab287 om T-cellen te herprogrammeren, waardoor een verbeterde antigeen-specifieke T-celtherapie voor T1D7wordt geboden.
Cytotoxische T-cellen worden gerapporteerd om hun doelwit te kunnen doden als zelfs een enkel exemplaar van hun verwant ligand wordt uitgedrukt8,9,10. Dus, B: 9-23/MHCII specifieke CD8 T cellen zullen naar verwachting een hogere efficiëntie hebben bij het elimineren van de ongewenste antigeen presentatie dan het bovenliggende antilichaam, die waarschijnlijk moet binden aan meerdere complexen op dezelfde APC om het effect uit te oefenen. Auto-T-cellen zijn gebruikt voor de behandeling van meerdere menselijke kankers11,12,13, en kan ook werkzaam zijn in auto-immuniteit14. Echter, auto-T cellen met specificiteit voor pathogene peptide-MHC complexen zijn tot nu toe niet gebruikt voor het wijzigen van de progressie van T1D. Door gebruik te maken van de geoptimaliseerde CD8 T celtransductie techniek die hieronder wordt beschreven, hebben we onlangs aangetoond dat dit inderdaad een levensvatbare aanpak is7.
In dit protocol schetsen we een efficiënte en gestroomlijnde transductie en uitbreidingsmethode. Ons protocol is van toepassing op andere studies die de generatie van muis CD8 auto T-cellen met een hoog rendement vereisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor de productie van antigeen-specifieke CD8 CAR-T-cellen door retrovirale transductie. De transductie-efficiëntie van ons protocol is meestal hoog en de robuuste uitdrukking van de auto wordt in het algemeen waargenomen. De uitgebreide auto T-cellen behouden de essentiële kenmerken van de ouder geactiveerde T-cellen en de specificiteit van het antilichaam, en zijn geschikt voor zowel in vitro als in vivo gebruik. We hebben AB-CAR CD8 T-cellen toegepast bij het opnieuw p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door JDRF subsidies 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-b, en SRA-2-S-2018-648-S-B, een diabetes onderwijs en actie Award, en het Caroline Wiess Law Fund voor onderzoek in moleculaire geneeskunde aan Baylor College of Medicine. Celsortering werd ondersteund door de Cytometrie-en Celsorteerkern op Baylor College of Medicine met financiering van de NIH (S10RR024574 en P30CA125123). Alle peptide-MHC tetramers werden verkregen van de NIH Tetramer core faciliteit.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
Riferimenti
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
- Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
- Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
- Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
- Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
- Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
- Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
- Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
- Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
- Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
- Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
- Johnstone, A., Thorpe, R. . Immunochemistry in practice. , (1996).
- Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. . Lymphocytes: a practical approach. , (2000).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
- Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
- Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).
- Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
- Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
- Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
- Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
- Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).
