Tau er en neuronal protein stede både i cytoplasma, hvor det binder mikrotubuli, og i kjernen, der det utøver ukonvensjonelle funksjoner inkludert modulering av Alzheimers sykdom-relaterte gener. Her beskriver vi en metode for å undersøke funksjonen av kjernefysiske tau mens unntatt eventuelle forstyrrelser som kommer fra cytoplasmatiske tau.
Tau er et mikrotubulinettverket bindende protein uttrykt i neurons og dens viktigste kjente funksjon er knyttet til vedlikehold av cytoskjelettkomponenter stabilitet. Men nyere bevis indikerte at tau er til stede også i andre subcellulære avdelinger inkludert kjernen der det er innblandet i DNA-beskyttelse, i rRNA transkripsjon, i mobilitet av retrotransposons og i den strukturelle organiseringen av nucleolus. Vi har nylig demonstrert at kjernefysiske tau er involvert i uttrykket av VGluT1 genet, antyder en molekylær mekanisme som kan forklare den patologiske økningen av glutamat utgivelse i de tidlige stadiene av Alzheimers sykdom. Inntil nylig har involvering av kjernefysiske tau i modulerende uttrykk for målet gener vært relativt usikkert og tvetydig på grunn av tekniske begrensninger som forhindret utelukkelse av bidraget fra cytoplasmatiske tau eller effekten av andre nedstrøms faktorer som ikke er knyttet til kjernefysiske tau. For å overvinne denne usikkerheten, utviklet vi en metode for å studere uttrykk for målet gener spesielt modulert av kjernefysiske tau protein. Vi brukte en protokoll som par bruk av lokalisering signaler og subcellulære fraksjonering, slik at utelukkelse av forstyrrelser fra cytoplasmatiske tau molekyler. Spesielt er protokollen enkel og består av klassiske og pålitelige metoder som er bredt aktuelt å studere kjernefysiske funksjon av tau i andre celletyper og cellulære forhold.
Funksjonene tau protein i kjernen har fått betydelig interesse de siste årene, som det har vist seg å være nært forbundet med nukleinsyre syrer1,2,3,4,5,6. Faktisk en nylig Genova bred studie viste at tau binder genic og intergenisk DNA-sekvenser i vivo7. En rolle i nucleolar organisasjon har blitt foreslått8,9,10,11. I tillegg har tau blitt foreslått å være involvert i DNA-beskyttelse mot oksidativt og hyperthermic stress5,10,12,13, mens mutert tau har vært knyttet til kromosom ustabilitet ogavvik 14,15,16.
Hittil har utfordringene i å studere funksjonene i tau i Atom rommet forble nesten uløst på grunn av vanskelighetene med å dissekere det konkrete bidraget fra kjernefysiske tau fra bidraget fra cytoplasmatiske tau. Videre funksjonene tilskrives tau molekyler i kjernefysiske rom, inntil nå, er bare correlative fordi de mangler en utvetydig demonstrasjon av direkte involvering av kjernefysiske tau proteiner. Faktisk, involvering av tau i mobiliteten av retrotransposons eller i rRNA transkripsjon eller i DNA–beskyttelse11,12,17,18,19 kan også forklares med bidraget fra cytoplasmatiske tau eller ved effekten av andre nedstrøms faktorer som ikke er relatert til kjernefysiske tau.
Her gir vi en metode som kan løse dette problemet ved å utnytte en klassisk prosedyre for å isolere Atom rommet kombinert med bruk av tau konstruerer 0N4R merket med kjernefysisk lokalisering (NLS) eller kjernefysiske eksport signaler (NES). Denne tilnærmingen eliminerer komplekse problemstillinger knyttet til mulige gjenstander på grunn av smitteeffekter av tau molekyler fra cytoplasmatiske kupé. Videre konstruerer tau-NLS og tau-NES den berikelse eller utelukkelse av tau molekyler fra kjernefysiske rom, henholdsvis gir positive og negative kontroller for involvering av kjernefysiske tau molekyler i en bestemt funksjon. Protokollen er teknisk lett og det er sammensatt av klassiske og pålitelige metoder som er bredt aktuelt å studere kjernefysiske funksjon av tau i andre celletyper, differensiert eller ikke, slik som kreftceller som reaktivere tau Expression20,21. Videre kan det brukes også til andre proteiner som er tilstede i både cytoplasma og kjernen for å analysere biologiske funksjoner knyttet til ulike avdelinger.
Vi beskriver en metode for å måle effekten av kjernefysiske tau protein på genuttrykk. Med denne protokollen er bidraget fra cytoplasmatiske tau sterkt begrenset. Kritiske trinn i denne protokollen er følgende: differensiering av menneskelige neuroblastom SH-SY5Y celler, subcellulære fraksjonering og lokalisering av tau protein i kjernefysiske kupé.
Først som vist i representative resultater delen, differensiering av SH-SY5Y celler ved å legge RA og BDNF er avgjørende for å få en go…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Scuola normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10000 |
anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10000 |
anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15000 |
anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500 |
anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5000 |
anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1000 |
Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1000 |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml, 100ml |
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |