Examiner la dynamique de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules épithéliales sur la fibronectine pendant le stress oxydatif

Summary

Cette méthode est utile pour quantifier la dynamique précoce de l’adhérence cellulaire et la propagation des cellules dépendantes de l’ancrage sur la fibronectine. En outre, cet analyse peut être employé pour étudier les effets de l’homéostasie altérée de redox sur la diffusion de cellules et/ou les voies intracellulaires liées à l’adhérence cellulaire.

Abstract

L’adhérence et la diffusion des cellules sur la matrice extracellulaire (ECM) sont des processus cellulaires essentiels pendant le développement de l’organisation et pour l’homéostasie des tissus adultes. Fait intéressant, le stress oxydatif peut modifier ces processus, contribuant ainsi à la physiopathologie de maladies telles que le cancer métastatique. Par conséquent, la compréhension du mécanisme (s) de la façon dont les cellules se fixent et se propagent sur l’ECM pendant les perturbations dans le statut redox peut fournir un aperçu des états normaux et de la maladie. Décrit ci-dessous est un protocole étape-sage qui utilise un jeu d’immunofluorescence-basé pour quantifier spécifiquement l’adhérence cellulaire et la diffusion des cellules immortalisées de fibroblaste sur la fibronectine (FN) in vitro. En bref, les cellules dépendantes à l’ancrage sont maintenues en suspension et exposées à l’inhibiteur de la kinase ATM Ku55933 pour induire un stress oxydatif. Les cellules sont ensuite plaquées sur la surface enduite de FN et autorisées à s’attacher pendant des périodes prédéterminées. Les cellules qui restent attachées sont fixes et étiquetées avec des marqueurs d’anticorps à base de fluorescence de l’adhérence (p. ex. la paxilline) et de la propagation (p. ex., F-actine). L’acquisition et l’analyse de données sont effectuées à l’aide d’équipements de laboratoire couramment disponibles, y compris un microscope à épifluorescence et un logiciel Fidji disponible gratuitement. Cette procédure est très polyvalente et peut être modifiée pour une variété de lignées cellulaires, protéines ECM, ou inhibiteurs afin d’examiner un large éventail de questions biologiques.

Introduction

Les adhérences de matrice cellulaire (c.-à-d. les adhérences focales) sont de grands et dynamiques complexes de protéines multimoléculaires qui entravent l’adhérence cellulaire et la propagation. Ces processus sont essentiels pour le développement, l’entretien et la fonction physiologique des tissus. Les adhérences focales sont composées de récepteurs liés à la membrane, tels que les intégrines, ainsi que de protéines d’échafaudage qui relient l’actine cytosquelettique à la matrice extracellulaire (ECM)¹. Ces complexes sont capables de répondre aux indices physiochimiques présents dans l’environnement extracellulaire grâce à l’activation de diverses voies de transduction de signalisation. En tant que tel, les adhérences focales servent de centres de signalisation pour propager des indices mécaniques extracellulaires dans un certain nombre de processus cellulaires, y compris la migration dirigée, la régulation du cycle cellulaire, la différenciation, et la survie^1,2. Un groupe de molécules de signalisation qui régulent et interagissent avec les adhérences focales comprend des membres de la famille Rho de petits GTPases. Les Rho GTPases sont des protéines clés qui régulent la migration cellulaire et la dynamique d’adhérence grâce à leur activation spatiotemporale spécifique³. Sans surprise, la dysrégulation de la fonction de protéine de Rho a été impliquée dans un certain nombre de pathologies humaines telles que la métastes, l’angiogenèse, et d’autres. D’intérêt particulier, le statut de redox cellulaire joue un rôle prédominant dans la modulation de la migration cellulaire et de l’adhérence. Des altérations de l’homéostasie redox, telles que l’augmentation des espèces réactives d’oxygène (ROS), ont été démontrées pour réguler l’activité de protéine de Rho, aussi bien que l’adhérence, dans un certain nombre de types de cellules et de maladies humaines^{4,5,6 ,7,8}. Par exemple, les personnes souffrant du trouble neurologique ataxie-telangiectasia (A-T), qui est causée par une mutation dans la réparation des dommages à l’ADN serine / thréonine kinase A-T-mutated (ATM), ont un risque accru de cancer métastatique^{9, 10}. La perte de l’activité de kinase d’ATM dans ces patients et lignes cellulaires, par la mutation génétique ou l’inhibition chimique, a comme conséquence des niveaux élevés de stress oxydatif dû au dysfonctionnement de la voie^dephosphate de pentose 7^{,11, 12}. En outre, des études récentes du laboratoire ont mis en évidence un rôle pathophysiologique pour ROS dans A-T en modifiant la dynamique cytosquelettique (c.-à-d. l’adhérence et la propagation) comme résultat direct de l’activation de la famille Rho GTPases in vitro⁵. En fin decompte, ces altérations de la dynamique cytosquelettique causée par l’activation de la famille Rho peuvent conduire à un risque accru de cancer métastatique noté chez les patients A-T^5,13. Par conséquent, la compréhension de l’interaction entre les interactions cellule-matrice pendant le stress oxydatif peut fournir un aperçu de la régulation de l’adhérence et de la propagation. Ces études peuvent également préparer le terrain pour d’autres investigations sur un rôle possible pour la famille Rho GTPases dans ces processus de signalisation.

Décrit ci-dessus est un protocole pour étudier la dynamique cellulaire tôt de l’assemblage d’adhérence et de se propageant pendant l’effort oxydant provoqué par l’inhibition de l’activité de kinase d’ATM. Cet assay est basé sur le mécanisme bien caractérisé de l’adhérence des cellules dépendantes de l’ancrage à la fibronectine de protéine d’ECM (FN). Lorsque les cellules maintenues en suspension sont plaquées sur FN, plusieurs Rho GTPases coordonnent le contrôle de l’actine cytosquelettique^3,14. Des changements morphologiques sont observés à mesure que les cellules passent de l’apparence ronde et circulaire à l’aplatiet et à l’expansion. En même temps que ces observations, il y a le développement de nombreuses adhérences matricielles avec l’ECM. Ces changements sont attribués à l’activation biphasique de RhoA avec Rac1 pendant la première heure que les cellules adhèrent et se propagent ^15,16.

Une variété de méthodes ont été utilisées pour examiner la morphologie et la dynamique de l’adhérence ainsi que la propagation cellulaire. Cependant, ces méthodes s’appuient sur des systèmes sophistiqués de fluorescence interne totale à long terme (TIRF) ou de microscopie confocale. Ainsi, les utilisateurs doivent avoir accès à de l’équipement et à des logiciels spécialisés. En outre, le temps d’configuration requis par ces systèmes de bio-imagerie rend la capture des événements d’adhérence précoce difficile, en particulier lors de l’essai de plusieurs inhibiteurs ou des conditions de traitement en même temps.

Les méthodes détaillées, ici, fournissent un moyen simple, économique, mais quantitatif pour évaluer les paramètres qui régissent l’assemblage d’adhérence et la propagation in vitro. Le protocole est exécuté à l’aide d’équipement de laboratoire couramment disponible, comme un microscope épifluorescence et une caméra CCD. Cet analyse consiste à appliquer des cellules dépendantes de l’ancrage à une surface enduite de FN après une période de stress oxydatif causée par l’inhibition chimique de l’activité kinase ATM, qui a été démontrée précédemment⁵. Après le placage, les cellules sont autorisées à se fixer et à adhérer pendant des durées déterminées. Les cellules non attachées sont lavées, tandis que les cellules attachées sont fixées et étiquetées avec des anticorps à base de fluorescence aux marqueurs d’adhérence (p. ex. de paxillin) et de propagation (p. ex., F-actin)^2,5. Ces protéines sont ensuite visualisées et enregistrées à l’aide d’un microscope à épifluorescence. L’analyse ultérieure des données est effectuée à l’aide du logiciel Fidji disponible gratuitement. En outre, cette méthode peut être adaptée pour examiner la dynamique d’adhérence dans un large éventail de conditions, y compris différentes protéines ECM, le traitement avec diverses conditions d’oxydants/culture cellulaire ou une variété de lignées cellulaires dépendantes de l’ancrage pour répondre à un large éventail de questions biologiques.

Protocol

1. Préparations REMARQUE : Le protocole décrit ci-dessous a été optimisé pour l’utilisation avec les cellules REF52 et les fibroblasteshumains. D’autres types de cellules peuvent nécessiter une optimisation plus poussée, comme décrit dans les notes et les sections de dépannage ci-dessous. Faire 500 ml de milieu de culture cellulaire complet pour les cellules REF52. À 500 ml de glucose élevé contenant le milieu modifié de l’aigle de Dulbecco (DMEM) a…

Representative Results

Un schéma général de la mise en place expérimentale La figure 1 représente le schéma général pour l’adhérence cellulaire et le protocole de propagation commençant par la famine de sérum des cellules REF52 et se terminant par l’analyse computationnelle des images acquises de fluorescence. Les étapes clés du protocole sont illustrées dans la chronologie. Il convient de noter que l’étape 2 du protocole décrit la préparation des fiches de couverture end…

Discussion

Le protocole décrit ici est un moyen polyvalent et économique de filtrer rapidement un certain nombre de types de cellules dépendantes de l’ancrage pour le cytosquelette dynamique remodelant pendant la propagation cellulaire. En particulier, cette méthode examine quantitativement la fibre de stress et la formation d’adhérence focale pendant le stress oxydatif lorsque les cellules adhèrent à la FN (figure 1A). En outre, ces phénotypes cellulaires peuvent suggérer un rôle réglementa…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25300-054	cell dissociation
10 cm2 dishes	Cell Treat	229620	sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes	Fisher Scientific	05-539-5	sterile
1X Phosphate Buffered Saline	Corning Cellgro	21-031-CV	PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates	Fisher Scientific	07-200-740	sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator	Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)	BD Transduction Laboratories	610620	marker of focal adhesions
Aspirator	Argos	EV310
Biosafety cabinet	Nuair	NU-477-400	Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder	Fisher Scientific	BP9704-100	dlBSA
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100	organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose	Fisher Scientific	11965092	REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	16000044	certified, cell culture medium supplement
Fiji	National Institutes of Health	http://fiji.sc/	image analysis program
Filter syringe	Fisher Scientific	6900-2502	0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5)	Fisher Scientific	12-545-81	autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum	Gibco by Life Technologies	16210-064	component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-107	for cell counting
Human Plasma Fibronectin	Gibco by Life Technologies	33016-015	FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope	Olympus		microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933	Sigma-Aldrich	SML1109-25MG	ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera	Optimos
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15-140-122	P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)	Invitrogen	A12381	marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36941	cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells			Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control	Corning Incorporated	PC-420D
Syringe	BD Biosciences	309653	60 mL syringe
Tissue culture incubator	Nuair
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution	Fisher Scientific	15-250-061	for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x)	Gibco by Life Technologies	R-002-100	TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator	Fisher Scientific	11-676-341
water bath	Fisher Scientific	FSGPD02