ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान फाइब्रोनेक्टिन पर सेलुलर आडंशन की गतिशीलता और एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार की जांच करना
Summary
इस विधि सेलुलर आसंजन के जल्दी गतिशीलता और फाइब्रोनेक्टिन पर लंगर पर निर्भर कोशिकाओं के प्रसार के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, इस परख सेल प्रसार और / या सेल आसंजन से संबंधित intracellular संकेतन रास्ते पर बदल redox homeostasis के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
कोशिकाओं का आसंजन और प्रसार कोशिकाओं को अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) पर होना जीव विकास के दौरान और वयस्क ऊतकों के होमियोस्टेसिस के लिए आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाएं हैं। दिलचस्प है, ऑक्सीडेटिव तनाव इन प्रक्रियाओं को बदल सकते हैं, इस प्रकार मेटास्टैटिक कैंसर जैसे रोगों के pathophysiology के लिए योगदान. इसलिए, कैसे कोशिकाओं को देते हैं और redox स्थिति में क्षोभ के दौरान ECM पर फैल के तंत्र को समझने के सामान्य और रोग राज्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. नीचे वर्णित एक कदम वार प्रोटोकॉल है कि एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित परख का इस्तेमाल करता है विशेष रूप से सेल आसंजन की मात्रा और फाइब्रोनेक्टिन पर अमर फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के प्रसार (FN) इन विट्रो में. संक्षेप में, लंगर पर निर्भर कोशिकाओं निलंबन में आयोजित कर रहे हैं और एटीएम kinase अवरोध करनेवाला Ku55933 के संपर्क में ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित करने के लिए. कोशिकाओं तो FN लेपित सतह पर चढ़ाया जाता है और समय की पूर्व निर्धारित अवधि के लिए संलग्न करने की अनुमति दी. संलग्न रहने वाली कोशिकाओं को स्थिर किया जाता है और आसंजन (उदा., पैक्सिलिन) के फ्लोरोसेंट-आधारित एंटीबॉडी मार्कर ों के साथ लेबल किया जाता है और फैल जाता है (उदा., एफ-एक्टिन)। डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण आमतौर पर उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं, एक epifluorscence माइक्रोस्कोप और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी सॉफ्टवेयर सहित. इस प्रक्रिया अत्यधिक बहुमुखी है और सेल लाइनों की एक किस्म के लिए संशोधित किया जा सकता है, ECM प्रोटीन, या inhibitors क्रम में जैविक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए.
Introduction
सेल-मैट्रिक्स आसंजन (यानी, फोकल आसंजन) बड़े और गतिशील बहु-अणुक प्रोटीन परिसर हैं जो सेल आसंजन को मध्यस्थता करते हैं और फैलते हैं। इन प्रक्रियाओं ऊतक विकास, रखरखाव, और शारीरिक समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं. फोकल आसंजन झिल्ली से बंधे रिसेप्टर्स से बना रहे हैं, इस तरह के integrins के रूप में, साथ ही मचान प्रोटीन है कि cytoskeletal actin को extracellular मैट्रिक्स (ECM)1से लिंक. इन परिसरों विभिन्न संकेतन transduction रास्ते के सक्रियण के माध्यम से extracellular वातावरण में मौजूद भौतिक रासायनिक संकेतों का जवाब देने में सक्षम हैं. इस प्रकार, फोकल आसंजन निर्देशित प्रवास, सेल चक्र विनियमन, भेदभाव, और अस्तित्व1,2सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की एक संख्या में extracellular यांत्रिक संकेतों का प्रचार करने के लिए संकेत केन्द्रों के रूप में सेवा करते हैं। संकेत अणुओं का एक समूह है कि विनियमित और फोकल आसंजन के साथ बातचीत छोटे GTPases के रो परिवार के सदस्य शामिल हैं. रो GTPases प्रमुख प्रोटीन है कि सेल प्रवास और आसंजन गतिशीलता उनके विशिष्ट spatiotemporal सक्रियण3के माध्यम से विनियमित कर रहे हैं. आश्चर्य नहीं कि रो प्रोटीन समारोह के डिस्रेगेशन को मेटास्टेसिस, एंजियोजेनेसिस, और अन्य जैसे कई मानव रोगों में फंसाया गया है। विशेष रुचि की, सेलुलर redox स्थिति सेल प्रवास और आसंजन के मॉडुलन में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. रेडॉक्स होमोस्टेसिस में परिवर्तन, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) में वृद्धि, रो प्रोटीन गतिविधि को विनियमित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, साथ ही आसंजन, सेल प्रकार और मानव रोगों की एक संख्या में4,5,6 ,7,8. उदाहरण के लिए, स्नायविक विकार ataxia-telangiectasia (ए-टी) से पीड़ित व्यक्तियों, जो डीएनए क्षति की मरम्मत serine में एक उत्परिवर्तन के कारण होता है/ 10| इन रोगियों और सेल लाइनों में एटीएम काइनेज गतिविधि की हानि, या तो आनुवंशिक उत्परिवर्तन या रासायनिक निषेध के माध्यम से, पेंटोस फॉस्फेट मार्ग7,11, के रोग के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव के उच्च स्तर में परिणामहै , 12. इसके अलावा, प्रयोगशाला से हाल के अध्ययनों से साइटोस्केलेटल गतिशीलता (यानी आसंजन और प्रसार) को इन विट्रो5में रो परिवार GTPases को सक्रिय करने का एक सीधा परिणाम के रूप में एक-टी में ROS के लिए एक pathophysiological भूमिका पर प्रकाश डाला गयाहै। अंत में, रो परिवार के सक्रियण के कारण साइटोस्केलेटल गतिशीलता में इन परिवर्तनों से ए – टी रोगियोंमेंनोट किए गए मेटास्टैटिक कैंसर का खतरा बढ़ सकता है5 ,13. इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान सेल-मैट्रिक्स बातचीत के बीच परस्पर क्रिया को समझने आसंजन और प्रसार के विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इन अध्ययनों से भी इन संकेतन प्रक्रियाओं में Rho परिवार GTPases के लिए एक संभावित भूमिका में आगे की जांच के लिए मंच निर्धारित कर सकते हैं.
इसके साथ वर्णित एक प्रोटोकॉल आसंजन विधानसभा के प्रारंभिक सेलुलर गतिशीलता का अध्ययन करने और एटीएम kinase गतिविधि के निषेध के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान फैल रहा है. यह परख ईसीएम प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) के लिए लंगर-निर्भर कोशिकाओं आसंजन की अच्छी तरह से विशेषता तंत्र पर आधारित है। जब निलंबन में बनाए रखा कोशिकाओं FN पर चढ़ाया जाता है, कई Rho GTPasses actin cytoskeletal remodeling3,14के नियंत्रण समन्वय . रूपात्मक परिवर्तन ों को देखा जाता है क्योंकि कोशिकाएं गोल और वृत्ताकार से उपस्थिति में चपटा और विस्तारित होती हैं। इन टिप्पणियों के साथ संगत ECM के साथ कई मैट्रिक्स आसंजन का विकास है. इन परिवर्तनों का कारण पहले घंटे के दौरान राक1 के साथ RhoA के द्वि-फासी सक्रियण के लिए दिया जाता है क्योंकि कोशिकाएं 15,16का पालन और प्रसार करते हैं .
तरीकों की एक किस्म आसंजन आकृति विज्ञान और गतिशीलता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल प्रसार की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, इन तरीकों परिष्कृत दीर्घकालिक, लाइव-इमेजिंग कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट (TIRF) या confocal माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर भरोसा करते हैं। इस प्रकार, उपयोगकर्ताओं को विशेष उपकरणों और सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, इन बायो-इमेजिंग सिस्टम द्वारा आवश्यक सेट-अप समय प्रारंभिक आसंजन घटनाओं को चुनौती देने में, खासकर जब कई अवरोधकों या उपचार की स्थिति का समवर्ती परीक्षण करता है।
विस्तृत तरीके, इसके साथ, आसंजन विधानसभा को नियंत्रित करने और विट्रो में फैलने वाले मापदंडों का आकलन करने के लिए एक सरल, किफायती, अभी तक मात्रात्मक तरीका प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर के लिए किया जाता है, इस तरह के एक epifluorscence माइक्रोस्कोप और सीसीडी कैमरा के रूप में. इस परख में एटीएम काइनेज गतिविधि के रासायनिक अवरोध के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव की अवधि के बाद एक एफएन लेपित सतह पर लंगर-निर्भर कोशिकाओं को लागू करना शामिल है, जोपहलेसे 5 प्रदर्शित किया गया है। चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को संलग्न और समय की निर्दिष्ट लंबाई के लिए पालन करने के लिए अनुमति दी जाती है। असंबद्ध कोशिकाओं को धोया जाता है, जबकि संलग्न कोशिकाओं को स्थिर किया जाता है और आसंजन (उदा., पैक्सिलिन) के मार्करों के लिए फ्लोरोसेंट आधारित एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है और फैल जाता है (उदा., एफ-एक्टिन)2,5। इन प्रोटीनों की कल्पना की जाती है और एपिफ्लोरेसीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रिकॉर्ड किया जाता है। बाद डेटा विश्लेषण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है. इसके अलावा, इस विधि विभिन्न ECM प्रोटीन सहित शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत आसंजन गतिशीलता की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, विभिन्न oxidants / सेल संस्कृति की स्थिति या लंगर पर निर्भर सेल लाइनों की एक किस्म के साथ उपचार की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए जैविक सवाल.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सेल प्रसार के दौरान गतिशील cytoskeleton remodeling के लिए तेजी से लंगर पर निर्भर सेल प्रकार के एक नंबर स्क्रीन करने के लिए एक बहुमुखी और किफायती तरीका है. विशेष रूप से, यह विधि मात्रात्मक रूप से ऑ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ों की पांडुलिपि की समीक्षा के लिए डॉ स्कॉट आर हटन और मेघन एस ब्लैकलेज का धन्यवाद करते हैं। यह काम उच्च बिंदु विश्वविद्यालय के अनुसंधान और प्रायोजित कार्यक्रम (एमसीएस) और उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय (एमसीएस) में जैव प्रौद्योगिकी कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
Riferimenti
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