Her presenterer vi lett å bruke protokoller for å produsere og rense diterpenoid metabolitter gjennom Kombinatorisk uttrykk for biosyntetiske enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, etterfulgt av kromatografiske produkt Rensing. De resulterende metabolitter er egnet for ulike studier inkludert molekylær struktur karakterisering, enzym funksjonelle studier, og bioactivity analyser.
Diterpenoids danner en mangfoldig klasse av små molekyl naturlige produkter som er vidt distribuert over livets riker og har kritiske biologiske funksjoner i utviklingsmessige prosesser, interorganismal interaksjoner, og miljømessige tilpasning. På grunn av disse ulike bioactivities er mange diterpenoids også av økonomisk betydning som farmasøytiske produkter, tilsetningsstoffer, biodrivstoff og andre bioprodukt. Avanserte Genomics og biokjemiske tilnærminger har aktivert en rask økning i kunnskap om diterpenoid-metabolske gener, enzymer og trasé. Imidlertid forblir den strukturelle kompleksiteten i diterpenoids og den smale taksonomisk fordelingen av individuelle forbindelser i ofte bare en enkelt Art Begrensende faktorer for effektiv produksjon. Tilgjengeligheten av et bredere spekter av metabolske enzymer gir nå ressurser for å produsere diterpenoids i tilstrekkelig titers og renhet for å lette en dypere undersøkelse av denne viktige metabolitten gruppen. Tegning på etablerte verktøy for mikrobiell og plante-baserte enzym co-Expression, presenterer vi en lett operert og passelig protokoll for enzymatisk produksjon av diterpenoids i enten Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, og rensing av ønskede produkter via silika kromatografi og semi-preparativ HPLC. Ved hjelp av gruppen av mais (Zea Mays) dolabralexin diterpenoids som et eksempel, understreker vi hvordan modulære kombinasjoner av diterpene syntase (diTPS) og cytokrom P450 monooxygenase (P450) enzymer kan brukes til å generere ulike diterpenoid stillaser. Renset forbindelser kan brukes i ulike nedstrøms applikasjoner, slik som metabolitten strukturelle analyser, enzym struktur-funksjon studier, og in vitro og i planta bioactivity eksperimenter.
Diterpenoids utgjør en kjemisk mangfoldig gruppe på mer enn 12 000 hovedsakelig polysykliske 20-karbon naturprodukter som spiller kritiske roller i mange organismer1. Sopp og planter produserer det største mangfoldet av diterpenoids, men bakterier har også vist å danne bioaktive diterpenoids (se anmeldelser2,3,4,5). Forankret i sitt store strukturelle mangfold, diterpenoids tjene en rekke biologiske funksjoner. Noen få diterpenoids, slik som gibberellin veksthormoner, har viktige funksjoner i utviklingsprosesser5. Men flertallet av diterpenoids tjene som meglere av kjemiske forsvar og interorganismal interaksjoner. Blant disse, diterpene harpiks syrer i pest og patogen forsvar av bartrær og arter-spesifikke blandinger av antimikrobielle diterpenoids i store mat avlinger som mais (Zea Mays) og ris (oryza sativa) har vært mest omfattende studerte6,7. Disse bioactivities gir en rik kjemisk oppbevaringssted for kommersielle applikasjoner, og velg diterpenoids brukes som viktige legemidler, tilsetningsstoffer, lim, og andre bioprodukt av hverdagen moderne liv8,9 ,10. For å fremme forskning på naturlige mangfoldet og biologiske funksjoner av diterpenoids og til slutt fremme bredere kommersielle applikasjoner, er verktøy for kostnadseffektiv utarbeidelse av rene forbindelser nødvendig. Stor skala isolasjon fra plantemateriale har blitt etablert for et par diterpenoid bioprodukt, slik som diterpene harpiks syrer som produseres som et biprodukt av cellulose-og papirindustrien8. Men akkumulering av diterpenoids i bare spesifikke vev og under tett regulering av miljømessige stimuli ofte begrenser isolering av tilstrekkelige produkt mengder fra den naturlige produsent2. I tillegg hemmer den strukturelle kompleksiteten i diterpenoids sin produksjon gjennom kjemisk syntese, selv om slike tilnærminger har vært vellykket i flere tilfeller11,12. Med tilgjengeligheten av avanserte genomisk og biokjemiske teknologier, har enzymatisk produksjonsplattformer fått økende oppmerksomhet for å produsere en rekke diterpenoid forbindelser (se anmeldelser13,14, 15,16,17,18).
Alle terpenoider, inkludert diterpenoids, er avledet fra to isomere isoprenoid forløpere, isopentenyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (IPP) og dimethylallyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (DMAPP)19 som i sin tur dannes gjennom MEVALONAT (mva) eller methylerythritol-5-fosfat (MEP) veien. Terpenoid biosyntesen provenyet gjennom MEP veien i bakterier og MVA-veien i sopp, mens plantene har en cytosolic MVA og en plastidial MEP veien, med sistnevnte er den primære ruten mot diterpenoid formasjon20. Kondens av IPP og DMAPP ved prenyl transferases gir den sentrale 20-karbon forløperen til alle diterpenoids, geranylgeranyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (GGPP)20. Nedstrøms av GGPP formasjon, to enzym familier, terpen synthases (TPSs) og cytokrom P450 monooxygenases (P450s) i stor grad kontroll dannelsen av det store kjemiske mangfoldet av terpenoid metabolisme21,22. Diterpene synthases (diTPSs) katalysere begått carbocation-drevet syklisering og omorganisering av GGPP å danne ulike stereospecific bi-, Poly-, eller makro-syklisk Diterpene stillaser1,3,23, 24. Oksygenering og videre funksjonell dekorasjon av disse stillaser er så tilrettelagt av P450 enzymer og velg andre enzym familier22,25. TPSs og P450s vanligvis eksisterer som arter-spesifikke, multi-genet familier som kan danne modulære biosyntetiske nettverk, der kombinere ulike enzym moduler langs en felles blåkopi gjør dannelsen av et bredt spekter av forbindelser2, 26. den raske oppdagelsen av funksjonelt distinkte enzymer som opererer i modulære terpenoid trasé de siste årene har gitt ekspanderende muligheter for deres bruk som en allsidig deler liste for metabolske engineering av delvis eller fullstendig trasé i både mikrobielle og plante-baserte produksjonsplattformer. For eksempel, gjær (Saccharomyces cerevisiae) har vært brukt med hell til ingeniør multi-enzym trasé for fremstilling av terpenoid bioprodukt, slik som antimalariamidler stoffet Artemisinin27, sesquiterpenoid biodrivstoff bisabolene og far nesene28, men også velge diterpenoids29,30,31. På samme måte er det etablert Escherichia coli -plattformer for industriell skala produksjon for et par diterpenoid metabolitter, inkludert Taxol-forløperen taxadiene brukt som anti-kreft-stoff og diterpene alkohol, sclareol , brukt i duftbransjen13,32,33,34. Fremskritt innen genteknologi og transformasjon teknologier har også gjort anlegget vertssystemer stadig mer levedyktig for produksjon av plante naturprodukter9,14,35,36. Spesielt den nære tobakk slektning, Nicotiana benthamiana, har blitt en mye brukt chassis for terpenoid veien analyse og engineering, på grunn av den enkle Agrobacterium-mediert transformasjon av flere gen kombinasjoner , effektiv biosyntesen av endogene forløpere, og høy biomasse14,35,36.
Tegning på disse etablerte plattformene for terpenoid biosyntesen, beskriver vi her lett-å-bruke og kostnadseffektive metoder for enzymatisk produksjon av diterpenoids og rensing av enkelt forbindelser. De presenterte protokollene illustrerer hvordan E. coli og N. benthamiana plattformer konstruert for forbedret diterpenoid forløper biosyntesen kan utnyttes for Kombinatorisk uttrykk for ulike diTPSs og P450 enzymer for å generere ønskede diterpenoid forbindelser. Anvendelse av denne protokollen til å produsere og rense strukturelt forskjellige diterpenoids vises ved eksempel på spesialiserte diterpenoids fra mais (Zea Mays), kalt dolabralexins, endogene biosyntesen som rekrutterer to diTPS og en P450 Enzym. Rensing av ulike dolabralexins fra olefins til oksygenrikt derivater oppnås deretter ved å kombinere separatory trakt ekstraksjon med stor skala silika kolonne kromatografi og preparativ høytrykks væske kromatografi (HPLC). De beskrevne protokollene er optimalisert for produksjon av diterpenoids, men kan også lett tilpasses for relaterte terpenoid klasser, så vel som andre naturlige produkter som enzym ressurser er tilgjengelige. Forbindelser som produseres ved hjelp av denne tilnærmingen er egnet for ulike nedstrøms applikasjoner, inkludert men ikke begrenset til, strukturelle karakterisering via kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) analyse, bruk som underlag for enzym funksjonelle studier, og en rekke bioactivity analyser.
Bredere undersøkelse og anvendelse av diterpenoid naturlige produkter nødvendiggjør enkle, rimelige protokoller for å syntetisere og rense tilstrekkelige mengder ønskede forbindelser. Den raske økningen i antall tilgjengelige diterpenoid-metabolske enzymer fra et bredt spekter av arter gir nå en ekspansiv inventar for enzymatisk produksjon av diterpenoids ved hjelp av mikrobielle og plante-baserte vertssystemer. I tillegg gjør den modulære arkitekturen til mange diterpenoid trasé bruk av enzymer fra samme eller forskjellige arter i plug & Play ‘ Kombinatorisk engineering tilnærminger til å generere en rekke naturlige og nye natur-lignende diterpenoid naturlig produkter2,14,26,35.
E. coli er en foretrukket mikrobiell vert for naturlig produkt biosyntesen på grunn av sin robusthet, enkel skalerbarhet, begrenset kjemisk kompleksitet for redusert biprodukt forurensning, og vell av tilgjengelige verktøy for DNA-montering og uttrykk Optimalisering. I vår erfaring, plattformen er beskrevet her er godt egnet for produksjon av produktet gir av opptil flere hundre mg diterpene olefins og alkoholer, som er egnet for mange nedstrøms applikasjoner, inkludert de som foreslås her. Selv om det ikke møter industriell skala, kan produksjonsplattformen som beskrives her, tjene som grunnlag for videre vei, vert og gjæring optimalisering som har blitt demonstrert for relaterte diterpenoids som taxadiene og sclareol33 ,34. Over-uttrykk for rate-begrensende MVA eller MEP veien gener har blitt etablert for å overvinne yield-Begrensende faktorer for diterpenoid biosyntesen, slik som utilstrekkelig forløper forsyning og forløper Flux i konkurrerende trasé13, 32,33,39. Selv vist seg vellykket i flere studier, dårlig uttrykk og katalysator aktivitet av terpenoid-metabolsk eukaryote P450s og andre membran-bundet enzymer i E. coli er en sannsynlig begrensende faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Bruk av Codon-optimalisert sekvenser og protein modifikasjoner, slik som fjerning av endoplasmatiske retikulum signal peptid eller innføring av et plastidial signal peptid, har vist seg nyttig å øke løselig P450 uttrykk14,38 ,49,50,53. Slike modifikasjoner ble også brukt for mikrobiell co-uttrykk for mais CYP71Z1839 brukes som et eksempel vei i denne studien. Protokollene beskrevet er basert på bruk av plasmider bærer en eller to gener per konstruere, alle under samme induserbart promoter. Der større-skala gen kombinasjoner er ønskelig, er det tilrådelig å bruke ulike tilgjengelige multi-genet kassetter eller gen stabling systemer for å redusere redusert transformasjon effektivitet og kultur vekst på grunn av bruk av flere plasmider og antibiotika13 .
Med den bredere tilgjengeligheten av genetikk og Genomics ressurser, anlegg vertssystemer også blitt stadig mer egnet for fremstilling av naturlige produkter. Fordelene inkluderer evne til planter for å produsere de nødvendige naturlige forløpere drevet av fotosyntese, og dermed muliggjør produkt dannelse uten behov for å supplere forløper molekyler54,55. N. benthamiana er allerede mye brukt for in vivo funksjonell karakterisering og Kombinatorisk uttrykk for terpenoid og andre naturlige produkt veier14,35,36,40 . Bemerkelsesverdige fordelene ved å bruke N. benthamiana som et vertssystem inkluderer den endogene produksjonen av diterpenoid forløpere, bruk av innfødte gen sekvenser, forenklet uttrykk for eukaryote P450s, enkel Kombinatorisk gen transformasjon (som separate antibiotika er ikke nødvendig for forbigående co-transformasjon), og enkel ekstraksjon av mål produkter fra blad materiale. Der det er nødvendig, kan diterpenoid produksjon forsterkes gjennom co-uttrykk for viktige MEP Pathway gener å øke forløperen Supply36,41. Begrensninger for skalerbar diterpenoid produksjon i N. benthamiana er mer komplekse i forhold til flytende mikrobielle kulturer på grunn av behovet for å generere tilstrekkelig plante biomasse, mer arbeidsintensiv produkt rensing fra kjemisk kompleks plante vev, og mulige uønskede metabolization av mål produkter gjennom, for eksempel, oksidasjon, glykosylering eller defosforylering av endogene enzymer36,43,44,45 ,46,47. Imidlertid kan denne fremgangsmåten skaleres opp til mg produkt mengder ved å øke antall planter som brukes for agroinfiltration56.
Produktet utvinning og rensing protokoller beskrevet her er kompatible med E. coli og N. Benthamiana, samt S. cerevisiae og andre plante-eller mikrobielle vertssystemer, og gir en kostnadseffektiv tilnærming som er lett å satt opp i både biologi og kjemi laboratorier og krever ikke dyrt renseutstyr. Metabolitten ekstraksjon ved hjelp av en separatory trakt er velegnet for effektiv ekstraksjon og fase separasjon før kromatografiske rensing. Trakt størrelser kan lett justeres for å muliggjøre større kultur volumer og redusere eksperimentell tid som trengs for å trekke ut fra store kulturer. Vi fant bruk av en Heksan/etanol acetate gradient å være ideell for utpakking diterpenoids av ulike polaritet som demonstrert her for gruppen av dolabralexins som utgjør både hydrokarboner og oksygenert forbindelser (Figur 3). Avhengig av egenskapene til mål produkter, kan andre løsemiddel blandinger være fordelaktig. Løsemidler må imidlertid ikke blandbar med vann for å sikre vellykket ekstraksjon og fase separasjon ved hjelp av separatory trakt teknikk. I tillegg må produkttap gjennom fordampning tas hensyn til ved bruk av denne tilnærmingen for å produsere flyktige organiske forbindelser (VOC), for eksempel lavere molekylvekt mono-og sesqui-terpenoider og andre VOC. Kromatografiske separasjon av diterpenoids av ulike nivåer av oksygenering bruke en større skala (~ 2 L) silica kolonne har vært fordelaktig i vår erfaring, siden det gir forbedret produkt separasjon og minimerer behovet for gjentakende rensing trinn ved bruk av mindre Kol onne volumer. Kolonne volumer og matriser kan justeres etter behov for ønsket kultur volum og type naturlig produkt. Renheten av mål produkter som kan oppnås ved hjelp av denne protokollen er egnet for mange nedstrøms programmer, for eksempel bioactivity analyser eller for bruk i enzym aktivitet analyser. Men hvor høyere renhet nivåer er nødvendig, for eksempel strukturelle analyser via NMR, produktrenhet kan effektivt forsterkes av ytterligere rensing bruker (semi)-preparativ HPLC.
Denne protokollen er beskrevet her er optimalisert for produksjon av diterpenoid naturlige produkter, men kan også lett tilpasses til beslektede mono-, sesqui-og Tri-terpenoider, samt andre naturlige produkt klasser bare ved å generere ønsket enzymet moduler for Kombinatorisk Expression14,57. Endringer i prosedyrene for uttrekking og rensing av produkter må imidlertid tas i betraktning for forbindelser med høyere volatilitet, for eksempel mono-og sesqui-terpenoider, eller høyere polaritet og funksjonell modifikasjon som et eksempel på glykosylering av mange triterpenoids, phenylpropanoids og andre naturlige produkt klasser.
Selv om industrielle plattformer for produksjon av naturlige produkter er tilgjengelige, protokollene beskrevet her tilbyr en billig, passelig verktøy som lett kan settes opp i de fleste laboratorier. Som demonstrert av produksjon av mais dolabralexins her og andre steder39, produktet mengder og renhet som kan oppnås ved hjelp av denne tilnærmingen er vanligvis tilstrekkelig til å lette ulike nedstrøms analyse og bruk, inkludert, men ikke begrenset til, ulike bioactivity studier, analyse av interaksjoner mellom organismer, så vel som for bruk som enzym underlag eller som start materiale for semi-syntese tilnærminger.
The authors have nothing to disclose.
Vi takknemlig erkjenner Dr. Reuben Peters (Iowa State University, USA) for å gi pIRS og pGGxZmAN2 konstruksjoner. Finansiell oppbacking for denne arbeide av det NSF plante-biotiske vekselsvirkningene program (støtte # 1758976 å P.Z.), det DOE tidlig karrieren forskning program (støtte # DE-SC0019178 å P.Z.), det DOE skjøt Genova off fellesskapet vitenskap program (støtte # CSP2568 å P.Z.), det NSF Graduate Research Fellowship Program (til K.M.M.), og en UC Davis Dean ‘ s mentorer Award Fellowship (til K.M.M.) er takknemlig erkjent.
1020 Trays | Greenhouse Megastore | CN-FLHD | |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M8250-500g | MES |
4" Tech Square Pot | McConkey Wholesale Grower's Supply | JMCTS4 | |
5977 Extractor XL MS | Agilent | – | |
7890B GC | Agilent | – | |
Acetonitrile | Sigma | 271004 | |
Agar | Fisher | BP1423-2 | |
Bacterial yeast extract | Fisher | BP9727-2 | |
Beaker | CTechGlass | BK-2001-015B | |
Cap, 9 mm blue screw, PFTE | Agilent | 5185-5820 | GC vial cap |
Carbenicillin | Genesee | 25-532 | Carb |
Chloramphenicol | Fisher | 50247423 | Chlor |
Chromatography column | CTechGlass | CL-0015-022 | |
Clear humidity dome | Greenhouse Megastore | CN-DOME | |
ColiRollers Plating Beads | Sigma | 71013 | Glass beads |
CoorsTek Porcelain Mortars | Fisher | 12-961A | mortar |
CoorsTek Porcelain Pestles | Fisher | 12-961-5A | pestle |
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride | Sigma | 50981039 | Aminoleuvolinic acid |
Ethanol | Fisher | A962-4 | EtOH |
Ethyl acetate | Fisher | E1454 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | Falcon tubes |
Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | cuvette |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | petri dish |
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks | Fisher | 05-541 | microtube rack |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Glycerol | Fisher | G33-500 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 (CS) | |
HP-5MS | Agilent | 19091S-433 | GC column |
Inlet adapter | CTechGlass | AD-0006-003 | glass inlet adapter |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher | BP1755-100 | IPTG |
Kanamycin | Fisher | BP9065 | Kan |
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase | VWR | 60825-798 | breathable test tube lids |
Magnesium chloride | Acros | 223210010 | MgCl2 |
Magnesium sulfate | Sigma | M7506-500g | MgSO4 |
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2756810 | |
Mixer Mill MM 200 | Retsch | 20.746.0001 | tissue mill |
Nalgene Fernbach culture flask | Sigma | Z360236 | 2.8 L flask |
New Brunswick I26 | Eppendorf | M1324-0000 | Shaking incubator |
Nicotiana benthamiana seed | USDA Germplasm Repository | Accession TW16 | N. benthamiana |
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells | Lucigen | 60442 | C41-DE3 cells |
Parafilm M wrapping film | Fisher | S37440 | Parafilm |
Potassium chloride | Sigma | P-9541 | KCl |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | P288-3 | Dipotassium phosphate |
Potassium phosphate monobasic | Monopotassium phosphate | ||
Pyrex disposable culture tubes, rimless | Sigma | CLS9944516 | test tubes |
Pyruvate Acid Sodium Salt | Fisher | 501368477 | Sodium pyruvate |
Retort Ring Stands | CTechGlass | ST00 | ring stand |
Riboflavin | Amresco | 0744-250g | |
Rifampicin | Sigma | R7382 | Rif |
Rotovap | |||
Sand, 50-70 mesh particle size | Sigma | 274739-1KG | |
Silica | Fisher | AC241660010 | silica gel |
Sodium chloride | Fisher | 5271-3 | NaCl |
Sodum hydroxide | Fisher | SS266-1 | NaOH |
Spectinomycin | Fisher | 501368607 | Spec |
Squibb Separatory Funnel | CTechGlass | FN-1060-006 | Separatory funnel |
Sunshine Mix #1 | Sungro Horticulture | Potting soil | |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher | 21-402-902 | microtube |
Triangle funnel | CTechGlass | FN-0035 | funnel |
Tryptone | Fisher | BP14212 | |
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn | Agilent | 5182-0716 | GC vial |
visible spectrophotometer, V-1200 | VWR | 634-6000P | spectrophotometer |
ZORBAX Eclipse XDB-C18 | Agilent | 990967-202 | HPLC column |
ZORBAX Eclipse XDB-CN | Agilent | 990967-905 | HPLC column |