इस प्रोटोकॉल को भ्रूण से वयस्क तक हर विकासात्मक चरण में ड्रोसोफिला की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। विधि का उपयोग विभिन्न जीनोटाइपों या विकास स्थितियों की व्यवहार्यता को निर्धारित करने और उनकी तुलना करने के लिए किया जा सकता है।
Drosophila मेलेनोगैस्टरमें, व्यवहार्यता परख कुछ आनुवंशिक पृष्ठभूमि की फिटनेस निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है. एलीगिक विविधताओं के परिणामस्वरूप विकास के विभिन्न चरणों में व्यवहार्यता की आंशिक या पूर्ण हानि हो सकती है। हमारी प्रयोगशाला भ्रूण से पूरी तरह से परिपक्व वयस्क के लिए Drosophila में व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक विधि विकसित की है. विधि विकास के दौरान विभिन्न चरणों में मौजूद संतान की संख्या की मात्रा निर्धारित करने पर निर्भर करता है, रचित भ्रूण के साथ शुरू. भ्रूणों की मात्रा निर्धारित करने के बाद, अतिरिक्त चरणों की गणना की जाती है, जिसमें एल1/एल 2, प्यूपा और परिपक्व वयस्क शामिल हैं। सभी चरणों की जांच करने के बाद, ची-वर्ग परीक्षण जैसे सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि क्या संतान की प्रारंभिक संख्या (हैच्ड भ्रूण) और बाद के चरणों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है जो वयस्कों की मनाया संख्या में समाप्त होता है, इस प्रकार शून्य परिकल्पना को अस्वीकार या स्वीकार करना (कि बच्चे पैदा हुए भ्रूणों की संख्या विकास के चरणों में दर्ज लार्वा, प्यूपा और वयस्कों की संख्या के बराबर होगी)। इस परख का प्राथमिक लाभ अपनी सादगी और सटीकता है, क्योंकि यह एक भ्रूण कुल्ला की आवश्यकता नहीं है उन्हें भोजन शीशी के लिए हस्तांतरण, तकनीकी त्रुटियों से नुकसान से बचने. यद्यपि यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सीधे L2/L3 लार्वा की जाँच नहीं करता है, अतिरिक्त चरणों को इन के लिए खाते में जोड़ा जा सकता है। अंडे से निकलने वाले भ्रूणों, एल 1, प्यूपा और वयस्कों की संख्या की तुलना करने से यह निर्धारित करने में मदद मिल सकती है कि आगे के अध्ययनों के लिए एल 2/एल 3 चरणों के दौरान व्यवहार्यता के साथ समझौता किया गया था या नहीं (रंगीन भोजन का उपयोग लार्वा की दृश्य पहचान के साथ मदद करता है)। कुल मिलाकर, इस विधि Drosophila शोधकर्ताओं और शिक्षकों की मदद कर सकते हैं निर्धारित जब व्यवहार्यता मक्खी जीवन चक्र के दौरान समझौता किया है. इस परख का उपयोग कर शेयरों की नियमित आकलन माध्यमिक उत्परिवर्तनों कि मूल रूप से अलग उत्परिवर्ती के phenotype को प्रभावित कर सकते हैं के संचय को रोका जा सकता है, खासकर अगर मूल उत्परिवर्तनों फिटनेस को प्रभावित. इस कारण से, हमारी प्रयोगशाला हमारे डीएम ime4 alleles में से प्रत्येक के कई प्रतियां रखता है और नियमित रूप से अन्य आणविक विश्लेषण के अलावा इस विधि के साथ प्रत्येक शेयर की शुद्धता की जाँच करता है.
लाइफस्पैन आनुवंशिक और गैर-आनुवंशिक कारकों से प्रभावित होता है। कमरे के तापमान पर मानक प्रयोगशाला वृद्धि की स्थिति में, हमारी प्रयोगशाला ने समान परिस्थितियों में उगाए गए विभिन्न डीएम आईएम4 एलेल्स के बीच स्वास्थ्य और व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण भिन्नता देखी है (चित्र 1 और पूरक आंकड़े)। जनसंख्या आनुवंशिक अध्ययन1,2,3,4में एक निश्चित एलील संयोजन या वृद्धि की स्थिति के प्रभावों की जांच करने के लिए प्राय : व्यवहार्यता अध्ययन किए जाते हैं . तथापि, उत्परिवर्तनों के एक गैर-पूरक समूह के भीतर व्यवहार्यता का विस्तृत विश्लेषण वैज्ञानिक साहित्य में मिलना कठिन है। एक एलेले को आमतौर पर “गैर-जरूरी” कहा जाता है यदि शोधकर्ता को कुछ व्यक्तियों को भोजन की शीशी के भीतर उस एलेके के लिए समयुग्मज लगता है जिसमें संतुलित स्टॉक5,6है। तथापि, सटीक ची-वर्ग विश्लेषण यह आकलन करने के लिए कि क्या ये समयुग्मज अपेक्षित मेंडेलियन अनुपात में उत्पन्न होते हैं,5,6की सूचना नहीं दी जाती है . किसी भी Drosophila स्टॉक के लिए सबसे स्वीकार्य तापमान कमरे का तापमान (22-23 डिग्री सेल्सियस) है और उपयुक्त पोषक तत्वों के साथ, जंगली प्रकार मक्खियों के जीवन चक्र लगभग बारह दिन लगते हैं7,8पूरा करने के लिए. चूंकि जंगली-प्रकार के ड्रोसोफिला के प्रत्येक विकासात्मक चरण की अवधि7,8ज्ञात है, इस रिपोर्ट में वर्णित विधि का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि अध्ययन के अंतर्गत ड्रोसोफिला स्ट्रेन प्रत्येक चरण में उपयुक्त है या नहीं। आनुवंशिक पृष्ठभूमि का परीक्षण के लिए उपयुक्त नियंत्रण की तुलना में. विकास9के एक विशिष्ट पहलू पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों के विपरीत, यह प्रोटोकॉल विभिन्न विकासात्मक चरणों में व्यवहार्यता का आकलन करने का एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है।
हमारी प्रयोगशाला में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग मीयोसिस 4 (डीएम आईम4)के ड्रोसोफिला प्रेरक के लिए कमी वाले स्टॉक की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया जाता है। डीएम Ime4 एक आवश्यक जीन10 है कि Drosophila और अन्य बहुकोशिकीय जीवों में आरएनए चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ एक आरएनए मिथाइलट्रांसफरेस encodes5,6,10, 11 , 12 , 13 , 14 . CRISPR/Cas9 (पूरक चित्र) के माध्यम से उत्पन्न डीएम ime4 के उपन्यास alleles का शीघ्रता से मूल्यांकन करने के लिए, एक अंत बिंदु व्यवहार्यता परख किया गया था कि केवल संतुलित स्टॉक की शीशियों के भीतर उत्पादित वयस्क संतान की गणना (चित्र 1)। इस्तेमाल किए गए कुछ स्टॉक का वर्णन पिछले डीएम आईएम 4 रिपोर्ट5,6में किया गया था . समयुग्मज उत्परिवर्ती उप-मेन्लियन स्तरपर उभरा, जैसा कि ची-वर्ग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है (चित्र 1 और पूरक सामग्री)। यह आकलन करने के लिए कि क्या ये कम-से-कम अपेक्षित संख्याएं कम भ्रूण ों के कारण रखी जा रही हैं, या कम पैदा हुए भ्रूण, या L1/L2 या प्यूपा में व्यवहार्यता की हानि के कारण, हमने इन विकासात्मक चरणों में से प्रत्येक में गणना ओंठ शामिल करने के लिए ट्रैकिंग का विस्तार किया (चित्र 2, चित्र 3, चित्र 4, चित्र 5, चित्र 6, चित्र 7, चित्र 8, और चित्र 9) .
यहाँ, हम जंगली प्रकार (OreR) मक्खियों का उपयोग कर विधि का वर्णन. अनुभवजन्य अन्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि या Drosophila प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए इस विधि का परीक्षण करने के लिए, हम एक संदर्भ के रूप में OreR का उपयोग कर और प्रयोगात्मक जीव के अनुसार timepoints समायोजित करने की सलाह देते हैं। इस प्रोटोकॉल का मूल्यांकन आगे किया गया था ताकि कुंवारी जंगली-प्रकार की महिलाओं को पार करके वंशी की व्यवहार्यता का आकलन किया जा सके जिसमें पुरुषों के साथ एक विषमयुग्मज डीएम आईम4 उत्परिवर्ती स्टॉक5,6 ( चित्र4) था।
संक्षेप में, इस विधि Drosophilaमें व्यवहार्यता का एक सटीक और सरल मूल्यांकन प्रदान करता है. पूरे प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए लगभग 14 दिन लगते हैं। प्रक्रिया विशेषज्ञ तकनीकी कौशल की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, उचित समय, दैनिक टिप्पणियों का एक कार्यक्रम, और सावधान agar स्थानांतरण सटीकता और पुन: उत्पादन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है।
भोजन शीशी में अंगूर-आगर डिस्क भ्रूण साइड नीचे की नियुक्ति के अलावा, प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम एक खाद्य शीशी के लिए agar डिस्क स्थानांतरित कर रहा है कोई बाद में 48 एच भ्रूण संग्रह मिनी पिंजरों से अंगूर आगर प्लेट को हटाने के बाद. 48 एच के बाद आगर को स्थानांतरित करने के परिणामस्वरूप भ्रूण और लार्वा की हानि हुई, जो आगर डिस्क के निर्जलीकरण के कारण होने की संभावना है। L2/L3 संक्रमण की गणना करने के लिए, प्लेट को 72 ज के लिए इनक्यूबेट करने की आवश्यकता होती है। यदि यह चरण महत्वपूर्ण है, अंगूर आगर प्लेटें मोटा डाला जाना चाहिए और एक आर्द्र कक्ष शुष्कता को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. पार भ्रूण संग्रह पिंजरों कि 35 मिमी प्लेटों को समायोजित में स्थापित किए गए थे; हालांकि, इस प्रक्रिया के रूप में अच्छी तरह से बड़ा भ्रूण संग्रह पिंजरों का उपयोग किया जा सकता है, इस तरह के एक है कि 60 मिमी या 100 मिमी पेट्री प्लेटों को समायोजित के रूप में. खाद्य बोतलें तो उन आकारों को समायोजित करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल में जोड़े जा सकते हैं जो चरण हैं। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एल 2/एल3 संक्रमण आवश्यक समय और आगर के संभावित निर्जलीकरण के कारण प्लेटों पर परिमाणित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। इसके अतिरिक्त, लार्वा आगर की सतह पर अत्यधिक मोबाइल बन जाते हैं, जो उन्हें सही ढंग से गिनने के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करते हैं। 30 मिनट के लिए रेफ्रिजरेटर में प्लेटों रखकर या L2/L3 लार्वा की गिनती से पहले agar की सतह पर एक हल्के संवेदनाहारी (lidocaine समाधान) की कुछ बूँदें जोड़ने में मदद कर सकते हैं उन्हें और अधिक सही गिनती करने के लिए उनकी गतिविधियों को धीमा. इन संशोधनों के लिए एक चेतावनी है कि वे चर परिचय कर सकते हैं (ठंडा संवेदनशीलता, संवेदनाहारी संवेदनशीलता) और व्यवहार्यता परिणाम उलझन. यहां तक कि इन चरणों के बिना, रंगीन भोजन का उपयोग करके, शोधकर्ताओं भटक L3s/prepupae मात्रा के रूप में वे भोजन शीशियों के पक्ष में बसने के लिए pupation आरंभ कर सकते हैं. इस विधि के लिए एक सीमा यह है कि यह पार में इस्तेमाल वयस्कों की आवश्यकता है जीवित रहने के लिए भ्रूण संग्रह पिंजरों में पार स्थापित करने के लिए phenotyping के लिए सीओ2 के साथ anesthetized जा रहा है. Dm ime4 समयुग्मज उत्परिवर्ती पुरुषों अच्छी तरह से ठीक नहीं है और सीओ2 उपचार से जागने के बाद कुछ ही घंटों मर जाते हैं। छँटाई के लिए वयस्कों को स्थिर करने के लिए अन्य तरीकों का पता लगाया जा सकता है, जैसे कुछ मिनट के लिए रेफ्रिजरेटर में शीशियों रखने और फिर शीशियों को धीमा आंदोलन को धीमा करने और जल्दी और कुशलता से सॉर्ट करने के लिए कुचल बर्फ के लिए शीशियों को स्थानांतरित करें।
सहयोगी शक्तियों और व्यवहार्यता पर उनके प्रभाव की तुलना करने के अलावा, इस विधि को परिभाषित दवा यौगिकों के लिए संवेदनशीलता या प्रतिरोध स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य विधियों के विपरीत जो कोशिका संस्कृति में यौगिक विषाक्तताको 15,16,17,18, इस विधि में पूरे जीवों का उपयोग करता है, जिससे विकासात्मक प्रभावों का विश्लेषण करना आसान हो जाता है। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल और उसमें संशोधनों का उपयोग कर, allelic ताकत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Drosophila व्यवहार्यता पर पर्यावरणीय कारकों और रासायनिक यौगिकों के प्रभाव को मापने के लिए अनुमति देगा, fecundity, प्रजनन, उम्र, और की अवधि विकास चक्र.
The authors have nothing to disclose.
हमारा काम NIH 1R15GM1131-01 से CFH और NIH पीए -12-149 CFH के लिए वित्त पोषित है.
Antimold additive | Carolina | ||
Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
Metal spatula (small) | Carolina | ||
Microwave | Any | To cook grape agar | |
Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |