Presentato qui è una procedura passo-passo per indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione lipopolysaccharide intracheale diretta ed eseguire l'analisi FACS di campioni di sangue, liquido di lavaggio bronchoalveolar e tessuto polmonare. La minima invasività, la manipolazione semplice, la buona riproducibilità e la titolazione della gravità della malattia sono vantaggi di questo approccio.
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Articolo metodologico
Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La somministrazione di lipopolioaccharide (LPS) è un modo comune per studiare l'infiammazione polmonare e le lesioni polmonari acute (ALI) in piccoli modelli animali. Sono stati descritti vari approcci, come l'inalazione di LPS aerosolizzato e l'instillazione nasale o intratracheale. Il protocollo presentato descrive una procedura dettagliata passo-passo per indurre ALI nei topi mediante instillazione diretta InTRAtracheal LPS ed eseguire l'analisi FACS di campioni di sangue, liquido bal (Bron) e tessuto polmonare. Dopo la sedazione intraperitoneale, la trachea viene esposta e l'LPS viene somministrato tramite un catetere venoso da 22 G. Una reazione infiammatoria robusta e riproducibile con invasione di leucociti, upregulation delle citochine infiammatorie e interruzione della barriera alveolo-capillare viene indotta in poche ore a giorni, a seconda del dosaggio LPS utilizzato. La raccolta di campioni di sangue, fluido BAL e raccolta polmonare, nonché la lavorazione per l'analisi FACS, sono descritti in dettaglio nel protocollo. Anche se l'uso dell'LPS sterile non è adatto a studiare gli interventi farmacologici nelle malattie infettive, l'approccio descritto offre una minima invasività, una manipolazione semplice e una buona riproducibilità per rispondere a domande immunologiche meccanicistiche. Inoltre, la tezione della dose e l'uso di preparati LPS alternativi o ceppi di topo consentono la modulazione degli effetti clinici, che possono presentare diversi gradi di gravità ALI o in ritardo rispetto all'esordio tardivo dei sintomi della malattia.
Introduzione
I modelli animali sperimentali sono indispensabili nella ricerca immunitaria di base. La somministrazione di batteri interi o componenti microbici è stata spesso utilizzata in piccoli modelli animali per indurre l'infiammazione locale o sistemica1. Lipopolysaccharide (LPS, o endotossina batterica) è un componente della parete cellulare e antigene superficiale di batteri gram-negativi (ad esempio, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., o Legionella sp.). La molecola termostabile e grande (peso molecolare 1-4 x 106 kDa) è costituita da una moiety lipidica (Lipid A), regione centrale (oligosaccharide) e un polisaccharide O (o antigene O)....
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Protocollo
Questo protocollo sugli animali è stato approvato dal comitato locale per la cura degli animali (LANUV, Recklinghausen, Germania; protocollo n. 84-02.04.2015) ed è stato eseguito in conformità con le linee guida del National Institutes of Health per l'uso di animali vivi (pubblicazione NIH N. 85-23, rivisto 1996).
1. Induzione ALI
- Utilizzare topi adulti C57BL/6 di età di circa 10-12 settimane. Alloggiare gli animali in gabbie ventilate individualmente con libero accesso all'acqua e al chow standard dei roditori. Tuttavia, è possibile eseguire questo approccio sugli animali più giovani e con altri ceppi di topi.
- Conservar....
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Risultati
L'approccio descritto per indurre l'ALI nei topi è stato convalidato valutando l'espressione della citochina, l'infiltrazione dei granulociti dei neutrofili e l'interruzione della barriera alveolo-capillare 24 h e 72 h dopo l'instillazione di LPS. Gli animali iniettati da PBS fungevano da controllo. La somministrazione di LPS intratracheali ha indotto una robusta risposta infiammatoria polmonare. L'espressione del TNF-z nel tessuto polmonare è stata significativamente upregola, raggiungendo un aumento sostenuto e superio.......
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Discussione
La minima invasività, la manipolazione semplice e la buona riproducibilità sono caratteristiche chiave dell'approccio presentato per indurre ALI in un piccolo modello di roditore. L'uso di LPS invece di batteri interi nei modelli animali ha dei vantaggi. È un composto stabile e puro e può essere conservato in forma liofilizzata fino all'uso. È un potente stimolante per le risposte immunitarie innate attraverso il percorso TLR4, e la sua attività biologica può essere facilmente quantificata, facilitando la titolazione del.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Jan Kleiner e Susanne Schulz per aver fornito supporto tecnico. Gli autori riconoscono l'eccellente supporto della struttura centrale di citometria di flusso presso la facoltà di medicina dell'Università di Bonn. Gli autori non hanno ricevuto alcun finanziamento da alcuna organizzazione esterna. Parte dei dati forniti nella sezione dei risultati e illustrati nella figura 3 è già stata mostrata in una precedente pubblicazione8.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringhe da 1 ml | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| Siringhe da 10 ml | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) - FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorfina cloridrato | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 topi, femmina, 10 - 12 settimane | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µ m) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1''BD | , Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | , Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Filtro cellulare 70 &; m | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenasi di tipo I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deossiribonucleasi II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| Provette FACS, 5 ml | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | 551579 | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forcipe | Fine Science Tools, Heidelberg, Germania | 11049-10 | |
| Isoflurano | Baxter, Unterschleiß heim, Germania | ||
| Ketamina cloridrato | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germania | ||
| Lipopolisaccaridi (LPS) da Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Kit verde cellula morta riparabile | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Ratto purificato Anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Tampone per lisi dei globuli rossi | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, con L-glutammina e bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Forbici | Fine Science Tools, Heidelberg, Germania | 14060-09 | |
| Azoturo di sodio (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Forbici a molla | Fine Science Tools, Heidelberg, Germania | 15018-10 | |
| Pinze per tessuti | Fine Science Tools, Heidelberg, Germania | 11021-12 | |
| Tubi | Eppendorf, Amburgo, Germania | 30125150 | |
| Catetere venoso, calibro 22 | B.Braun, Melsungen, Germania | 4268091B | |
| Xilazina cloridrato | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germania |
Riferimenti
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R.
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Ristampe e permessi
