Optisk clearing og billeddannelse af Immunolabeled nyre væv
Summary
Kombinationen af antistof mærkning, optisk clearing, og avanceret lys mikroskopi tillader tredimensionel analyse af komplette strukturer eller organer. Beskrevet her er en simpel metode til at kombinere immunolabeling af tykke nyre skiver, optisk clearing med ethyl cinnamat, og confokale Imaging, der muliggør visualisering og kvantificering af tredimensionelle nyre strukturer.
Abstract
Optiske clearing teknikker gør vævet gennemsigtigt ved at ækvibrere brydningsindekset i en prøve for efterfølgende tredimensionelle (3-D) billeddannelse. De har fået stor opmærksomhed på alle forskningsområder for potentialet til at analysere mikroskopiske flercellede strukturer, der strækker sig over makroskopiske afstande. I betragtning af at nyre tubuler, vasculature, nerver, og glomeruli strækker sig i mange retninger, som kun er delvist fanget af traditionelle to-dimensionelle teknikker indtil videre, vævs rydning også åbnet mange nye områder af nyre forskning. Listen over optiske clearing metoder er hastigt voksende, men det er stadig vanskeligt for begyndere på dette område til at vælge den bedste metode til en given forskning spørgsmål. Forudsat her er en simpel metode, der kombinerer antistof mærkning af tykke mus nyre skiver; optisk clearing med billige, ikke-giftige og klar-til-brug kemisk ethyl cinnamat; og konfokal billeddannelse. Denne protokol beskriver, hvordan man kan perfuse nyrerne og bruge et antigen-hentning skridt til at øge antistof-binding uden at kræve specialiseret udstyr. Dens anvendelse præsenteres i Imaging forskellige flercellede strukturer i nyrerne, og hvordan man foretager fejlfinding af dårlig antistof penetration i væv er rettet. Vi diskuterer også de potentielle vanskeligheder ved Imaging endogene fluorophorer og erhverve meget store prøver og hvordan man overvinde dem. Denne enkle protokol giver en nem at setup og omfattende værktøj til at studere væv i tre dimensioner.
Introduction
Den stigende interesse i at studere hele organer eller store flercellede strukturer har ført til udviklingen af optiske clearing metoder, der involverer billeddannelse af gennemsigtigt væv i tre dimensioner. Indtil for nylig har de bedste metoder til at anslå celle nummer, længde eller volumen af hele strukturer været Stereologi eller udtømmende seriel skæring, som er baseret på den systemiske prøvetagning af væv til efterfølgende analyse i to dimensioner1, 2 , 3. disse metoder er imidlertid tidskrævende og har brug for en høj grad af uddannelse og ekspertise4. Optiske clearing metoder overvinder disse problemer ved at udligne brydningsindekset i en prøve for at gøre vævs gennemskinnelige for 3-D-billeddannelse5,6,7.
Der er udviklet flere optiske clearing metoder, som falder i to hovedkategorier: opløsningsmiddel baserede og vandige baserede metoder. Vandige-baserede metoder kan yderligere opdeles i simpel fordybelse8,9, hyperhydrering10,11, og hydrogel indlejring12,13. Opløsningsmiddelbaserede metoder dehydrere vævet, fjerne lipider og normalisere brydningsindekset til en værdi omkring 1,55. Begrænsninger af de fleste opløsningsmidler baserede metoder er dæmpning af endogene fluorescens af almindeligt anvendte reporter proteiner såsom GFP, solvent toksicitet, evne til at opløse lim, der anvendes i nogle billed kamre eller objektiv linser, og svind af væv under dehydrering14,15,16,17,18,19,20,21. Men, solvent-baserede metoder er enkle, tidsbesparende, og kan arbejde i en række forskellige vævstyper.
Vandige-baserede metoder er afhængige af nedsænkning af vævet i vandige opløsninger, der har brydningsindeks i intervallet 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Disse metoder blev udviklet for at bevare endogene fluorescerende reporter protein emission og forhindre dehydrering-induceret svind, men begrænsninger af de fleste vandig-baserede clearing metoder omfatter en længere varighed af protokollen, væv ekspansion, og protein modifikation (dvs. delvis denaturering af proteiner af urinstof i hyperhydrerende protokoller som SCALea2)7,11,23,25. SCALeS behandlede vævs ekspansion ved at kombinere urinstof med sorbitol, som modvirker ved dehydrering af urinstof-induceret vævs ekspansion og bevarede vævs ultrastrukturen som evalueret af elektronmikroskopi10. Vævs svind eller ekspansion påvirker de absolutte størrelser af strukturer, afstande mellem objekter eller celletæthed pr. volumen; således kan målingen af størrelsesændringer ved rydning af vævet hjælpe med at fortolke de opnåede resultater7,26.
Generelt består en protokol for optisk clearing af flere trin, herunder forbehandling, permeabilisering, immunolabeling (hvis påkrævet), brydningsindeks matchning og billeddannelse med avanceret lymikroskopi (f. eks. to-foton, confocal eller lysplade Fluorescens mikroskopi). De fleste af de clearing tilgange er blevet udviklet til at visualisere neuronal væv, og nye undersøgelser har valideret deres anvendelse i andre organer5. Dette omfattende værktøj er tidligere blevet påvist at tillade pålidelig og effektiv analyse af nyre strukturer, herunder glomeruli27,28, immun infiltrater28, Vaskulaturen28, og tubulus segmenter 29, og det er en ideel tilgang til bedre forståelse af glomerulær funktion og tubulus remodeling i sundhed og sygdom.
Opsummeret her er en solvent-baseret metode, der kombinerer immun farvning af nyre tubuler; optisk clearing med billige, ikke-giftige, og klar-til-brug kemisk ethyl cinnamat (ECi); og konfokal mikroskopi Imaging, der tillader komplet tubulær visualisering og kvantificering. Denne metode er enkel, kombinerer antigen-hentning af nyre skiver med farvning af kommercielle antistoffer, og kræver ikke specialiseret udstyr, hvilket gør det tilgængeligt for de fleste laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optisk clearing teknikker har fået stor opmærksomhed for 3-D visualisering og kvantificering af mikroanatomi i forskellige organer. Her blev opløsningsmiddel baseret clearing metode (ECi) kombineret med immunolabeling for 3-D billeddannelse af hele tubuler i nyre skiver. Denne metode er enkel, billig og hurtig. Andre forskningsspørgsmål kan dog bedst besvares med andre clearing protokoller5. Det er også vigtigt at huske på, at opløsningsmidler baseret metoder forårsage vævs svind i varie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. støttes af tilskud fra DFG German Research Foundation (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) og det medicinske fakultet i RWTH Aachen (RWTH returner-programmet). V. G. P. støttes af forskningsstipendier fra Deutsche Gesellschaft Fur Nephrologie, Alexander von Humboldt Foundation, og det nationale sundheds-og medicinsk Forskningsråd i Australien. D. H. E understøttes af Fondation LeDucq. R. K. støttes af tilskud fra DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), staten Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) og det tværfaglige Center for klinisk forskning ved RWTH Aachen Universitet (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
Riferimenti
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
