Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel
Summary
De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.
Abstract
Optische clearing technieken maken weefsel doorzichtig door de brekingsindex in een steekproef te equilibreren voor daaropvolgende driedimensionale (3-D) beeldvorming. Ze hebben veel aandacht gekregen in alle onderzoeksgebieden voor het potentieel om microscopische multicellulaire structuren te analyseren die zich uitstrekken over macroscopische afstanden. Gezien het feit dat nierbuisjes, vasculatuur, zenuwen en glomeruli zich in vele richtingen uitstrekken, die tot nu toe slechts gedeeltelijk zijn gevangen door traditionele tweedimensionale technieken, opende weefsel clearing ook veel nieuwe gebieden van nieronderzoek. De lijst van optische clearing methoden groeit snel, maar het blijft moeilijk voor beginners op dit gebied om de beste methode voor een bepaalde onderzoeksvraag te kiezen. Voorzien hier is een eenvoudige methode die antilichamen labelen van dikke muis nierschijfjes combineert; optische clearing met goedkope, niet-toxisch en kant-en-klare chemisch ethyl CINNAMAAT; en confocale beeldvorming. Dit protocol beschrijft hoe de nieren te parfuseren en een antigeen-ophaal stap te gebruiken om antilichaam binding te verhogen zonder gespecialiseerde apparatuur te vereisen. De toepassing wordt gepresenteerd in beeldvorming verschillende multicellulaire structuren binnen de nier, en hoe u problemen met slechte antilichamen penetratie in weefsel wordt aangepakt. We bespreken ook de potentiële moeilijkheden van het beeldvormende endogene fluor en het verwerven van zeer grote monsters en hoe ze te overwinnen. Dit eenvoudige protocol biedt een eenvoudig te installeren en uitgebreid hulpmiddel om weefsel in drie dimensies te bestuderen.
Introduction
De groeiende belangstelling voor het bestuderen van hele organen of grote multicellulaire structuren hebben geleid tot de ontwikkeling van optische clearing methoden die betrekking hebben op Imaging van transparante weefsel in drie dimensies. Tot voor kort waren de beste methoden om het aantal cellen, de lengte of het volume van hele structuren te schatten stereologie of uitputtende seriële snede, die is gebaseerd op de systemische bemonstering van weefsel voor latere analyse in twee dimensies1, 2 , 3. deze methoden zijn echter tijdrovend en hebben behoefte aan een hoog niveau van opleiding en expertise4. Optische clearing methoden overwinnen deze problemen door het evenwicht van de brekingsindex in een monster te maken van weefsel doorschijnend voor 3D-beeldvorming5,6,7.
Er zijn verschillende optische clearing methoden ontwikkeld die in twee hoofdcategorieën vallen: op oplosmiddel gebaseerde en waterige methoden. Waterige methoden kunnen verder worden onderverdeeld in eenvoudige onderdompeling van8,9, hyperhydratatie10,11, en hydrogel insluiten12,13. Oplosmiddel gebaseerde methoden dehydraat het weefsel, verwijderen lipiden en normaliseren de brekingsindex tot een waarde rond 1,55. Beperkingen van de meeste op oplosmiddelen gebaseerde methoden zijn het afschrikken van endogene fluorescentie van veelgebruikte reporter eiwitten zoals GFP, oplosmiddel toxiciteit, capaciteit om lijm op te lossen die wordt gebruikt in sommige beeldvormings kamers of objectieve lenzen, en krimp van weefsel tijdens Dehydratie14,15,16,17,18,19,20,21. Oplosmiddel gebaseerde methoden zijn echter eenvoudig, tijdbesparend en kunnen in een aantal verschillende weefsel typen werken.
Waterige methoden zijn afhankelijk van de onderdompeling van het weefsel in waterige oplossingen die brekingsindices hebben in het bereik van 1,38-1.528,11,12,22,23,24 . Deze methoden werden ontwikkeld om endogene fluorescerende reporter eiwit emissie te behouden en uitdroging veroorzaakte krimp te voorkomen, maar beperkingen van de meeste waterige gebaseerde clearing methoden omvatten een langere duur van het Protocol, weefsel uitbreiding, en eiwit modificatie (d.w.z. partiële denaturatie van eiwitten door ureum in hyperhydrerende protocollen zoals SCALea2)7,11,23,25. SCALeS gericht weefsel uitbreiding door het combineren van ureum met sorbitol, die tegenwicht door uitdroging van de ureum-geïnduceerde weefsel expansie, en behouden van de weefsel ultrastructuur zoals geëvalueerd door elektronenmicroscopie10. Weefsel krimp of-expansie beïnvloedt de absolute afmetingen van structuren, afstanden tussen objecten of celdichtheid per volume; Zo kan de meting van de grootte veranderingen bij het opruimen van het weefsel helpen bij het interpreteren van de verkregen resultaten7,26.
In het algemeen bestaat een protocol voor optische clearing uit meerdere stappen, waaronder voor behandeling, permeisatie, immunolabeling (indien nodig), brekingsindex matching en beeldvorming met geavanceerde Lichtmicroscopie (bijv. twee-foon, confocale of fluorescentiemicroscopie van licht blad). De meeste van de clearing benaderingen zijn ontwikkeld om neuronale weefsel te visualiseren, en opkomende studies hebben hun toepassing in andere organen5gevalideerd. Deze uitgebreide tool is eerder aangetoond dat het mogelijk maakt betrouwbare en efficiënte analyse van nierstructuren, met inbegrip van glomeruli27,28, immuun infiltraten28, therapieën28, en tubulus segmenten 29, en het is een ideale benadering om beter begrip van glomerulaire functie en tubulus remodellering in gezondheid en ziekte.
Samengevat hier is een oplosmiddel gebaseerde methode die immunokleuring van niertubuli combineert; optische clearing met goedkope, niet-toxisch en gebruiksklaar chemisch ethyl CINNAMAAT (EBI); en confocale microscopie beeldvorming die volledige tubulus visualisatie en kwantificering mogelijk maakt. Deze methode is eenvoudig, combineert antigeen-opvraging van nierschijfjes met kleuring van commerciële antilichamen, en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, waardoor het toegankelijk is voor de meeste laboratoria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optische clearing technieken hebben brede aandacht gekregen voor 3D-visualisatie en kwantificering van micro anatomie in verschillende organen. Hier werd solvent gebaseerde clearing Method (ECi) gecombineerd met immunolabeling voor 3D-beeldvorming van hele tubuli in nierschijfjes. Deze methode is eenvoudig, goedkoop en snel. Andere onderzoeksvragen kunnen echter het best worden beantwoord met andere clearing protocols5. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat op oplosmiddel gebaseerde …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. wordt ondersteund door subsidies van de DFG German Research Foundation (332853055), else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), en de medische faculteit van de RWTH Aachen (RWTH returner programma). V. G. P. wordt ondersteund door onderzoeksbeurzen van de Deutsche Gesellschaft fur Nefrologie, de Alexander von Humboldt Foundation en de National Health and Medical Research Council van Australië. D. H. E wordt ondersteund door Fondation LeDucq. R. K. wordt ondersteund door subsidies van de DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), de staat Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) en het Interdisciplinair Centrum voor klinisch onderzoek aan de RWTH Aachen University (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
Riferimenti
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
