Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato
Summary
La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l’analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l’etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l’imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.
Abstract
Le tecniche di compensazione ottica rendono trasparente il tessuto bilanciando l’indice di rifrazione in un campione per la successiva imaging tridimensionale (3D). Hanno ricevuto grande attenzione in tutte le aree di ricerca per il potenziale di analizzare strutture multicellulari microscopiche che si estendono su distanze macroscopiche. Dato che i tubuli renali, la vascolatura, i nervi e i glomeruli si estendono in molte direzioni, che finora sono stati catturati solo parzialmente dalle tradizionali tecniche bidimensionali, la pulizia dei tessuti ha aperto anche molte nuove aree di ricerca sui reni. L’elenco dei metodi di compensazione ottica è in rapida crescita, ma rimane difficile per i principianti in questo campo scegliere il metodo migliore per una determinata domanda di ricerca. Fornito qui è un metodo semplice che combina l’etichettatura anticorpale di fette di rene di topo spesse; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all’uso; e l’imaging confocale. Questo protocollo descrive come perfondere i reni e utilizzare un passaggio di recupero dell’antigene per aumentare il legame degli anticorpi senza richiedere attrezzature specializzate. La sua applicazione è presentata nell’imaging di diverse strutture multicellulari all’interno del rene, e come risolvere la scarsa penetrazione degli anticorpi nel tessuto è affrontato. Discutiamo anche delle potenziali difficoltà dell’imaging dei fluorofori endogeni e dell’acquisizione di campioni molto grandi e di come superarli. Questo semplice protocollo fornisce uno strumento facile da configurare e completo per studiare il tessuto in tre dimensioni.
Introduction
Il crescente interesse nello studio di interi organi o di grandi strutture multicellulari ha portato allo sviluppo di metodi di compensazione ottica che coinvolgono l’imaging di tessuto trasparente in tre dimensioni. Fino a poco tempo fa, i metodi migliori per stimare il numero di cellule, la lunghezza o il volume di intere strutture sono stati la stereologia o il sezionamento seriale esaustivo, che si basa sul campionamento sistemico del tessuto per l’analisi successiva in due dimensioni1, 2 Il nome del sistema , 3. Tuttavia, questi metodi richiedono molto tempo e necessitano di un elevato livello di formazione e competenza4. I metodi ottici di compensazione superano questi problemi bilanciando l’indice di rifrazione in tutto un campione per rendere il tessuto traslucido per l’imaging 3D5,6,7.
Sono stati sviluppati diversi metodi di compensazione ottica che rientrano in due categorie principali: metodi basati su solventi e acquosi. I metodi basati su aqueous possono essere ulteriormente suddivisi in semplice immersione8,9, iperidratazione10,11e idrogel incorporando12,13. I metodi a base di solvente disidratano il tessuto, rimuovono i lipidi e normalizzano l’indice di rifrazione a un valore intorno a 1,55. Limitazioni della maggior parte dei metodi a base di solventi sono la dorching della fluorescenza endogena di proteine reporter comunemente usate come GFP, tossicità dei solventi, capacità di sciogliere le colle utilizzate in alcune camere di imaging o lenti oggettive, e il restringimento dei tessuti durante disidratazione14,15,16,17,18,19,20,21. Tuttavia, i metodi basati sui solventi sono semplici, efficienti in termini di tempo e possono funzionare in diversi tipi di tessuto.
I metodi basati su aqueous si basano sull’immersione del tessuto in soluzioni acquose che hanno indici di rifrazione nell’intervallo di 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Questi metodi sono stati sviluppati per preservare l’emissione di proteine endogeniche di reporter fluorescenti e prevenire il restringimento indotto dalla disidratazione, ma i limiti della maggior parte dei metodi di compensazione basati su acquosi includono una durata più lunga del protocollo, l’espansione dei tessuti e modificazione delle proteine (cioè denaturazione parziale delle proteine mediante urea in protocolli iperidratanti come ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS ha affrontato l’espansione dei tessuti combinando l’urea con il sorbitolo, che controbilancia per disidratazione l’espansione dei tessuti indotta dall’urea, e ha conservato l’ultrastruttura dei tessuti valutata dalla microscopia elettronica10. Il restringimento o l’espansione dei tessuti influisce sulle dimensioni assolute delle strutture, sulle distanze tra gli oggetti o sulla densità delle cellule per volume; pertanto, la misurazione delle dimensioni cambia al momento della compensazione del tessuto può aiutare a interpretare i risultati ottenuti7,26.
In generale, un protocollo per la compensazione ottica è costituito da più passaggi, tra cui pretrattamento, permeabilizzazione, immunolabeling (se necessario), corrispondenza dell’indice di rifrazione e imaging con microscopia luminosa avanzata (ad esempio, a due fotone, confocali o microscopia a fluorescenza del foglio luminoso). La maggior parte degli approcci di compensazione sono stati sviluppati per visualizzare il tessuto neuronale, e studi emergenti hanno convalidato la loro applicazione in altri organi5. Questo strumento completo è stato dimostrato in precedenza per consentire un’analisi affidabile ed efficiente delle strutture renali, tra cui glomeruli27,28, infiltrati immunitari28, vascolatura28e segmenti di tubulo 29, ed è un approccio ideale per migliorare la comprensione della funzione glomerare e del rimodellamento del tubulo in salute e malattia.
Riassunto qui è un metodo a base di solventi che combina l’immunostaining dei tubuli renali; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all’uso (ECi); e l’imaging a microscopia confocale che consente una visualizzazione completa del tubulo e la quantificazione. Questo metodo è semplice, combina antigene-recupero di fette di rene con colorazione di anticorpi commerciali, e non richiede attrezzature specializzate, che lo rende accessibile alla maggior parte dei laboratori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le tecniche di compensazione ottica hanno ricevuto un’ampia attenzione per la visualizzazione 3D e la quantificazione della microanatomia in vari organi. In questo caso, il metodo di compensazione basato su solventi (ECi) è stato combinato con l’immunolabeling per l’imaging 3D di tubuli interi in fette di rene. Questo metodo è semplice, economico e veloce. Tuttavia, altre domande di ricerca possono essere meglio risolte con altri protocolli di compensazione5. È anche importante tenere a mente c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. è sostenuto da sovvenzioni della DFG German Research Foundation (332853055), else Kraner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) e della Facoltà di Medicina del RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. è supportato da borse di ricerca da Deutsche Gesellschaft pellicco Nephrologie, la Alexander von Humboldt Foundation, e il National Health and Medical Research Council dell’Australia. D. H. E è supportato da Fondation LeDucq. R. K. è supportato da sovvenzioni del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), dello Stato di Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e del Centro interdisciplinare di ricerca clinica presso la RWTH Aachen University (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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