Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim
Summary
A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.
Abstract
As técnicas óticas do esclarecimento rendem o tecido transparente equilibrando o índice refração durante todo uma amostra para a imagem latente tridimensional (3-D) subseqüente. Eles receberam grande atenção em todas as áreas de pesquisa para o potencial de analisar estruturas multicelulares microscópicas que se estendem por distâncias macroscópicas. Dado que os túbulos do rim, a vasculatura, os nervos, e os glomérulos estendem em muitos sentidos, que foram capturados somente parcialmente por técnicas bidimensionais tradicionais até agora, o esclarecimento do tecido igualmente abriu muitas áreas novas da pesquisa do rim. A lista de métodos de compensação óptica está crescendo rapidamente, mas continua a ser difícil para iniciantes neste campo escolher o melhor método para uma determinada questão de pesquisa. Fornecido aqui é um método simples que combina a rotulagem do anticorpo de fatias grossas do rim do rato; compensação óptica com cinetato de etilo químico barato, não tóxico e pronto a usar; e imagem latente confocal. Este protocolo descreve como perfuse rins e usa uma etapa do antígeno-recuperação para aumentar o anticorpo-emperramento sem exigir o equipamento especializado. Sua aplicação é apresentada em estruturas multicelulares diferentes da imagem latente dentro do rim, e como pesquisar defeitos a penetração pobre do anticorpo no tecido é endereçada. Discutimos também as dificuldades potenciais de fluoróforos endógenos de imagem e adquirindo amostras muito grandes e como superá-las. Este protocolo simples fornece uma ferramenta easy-to-setup e detalhada para estudar o tecido em três dimensões.
Introduction
O crescente interesse em estudar órgãos inteiros ou grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento de métodos de compensação óptica que envolvem imagens de tecido transparente em três dimensões. Até recentemente, os melhores métodos para estimar o número de células, o comprimento ou o volume de estruturas inteiras foram a estereologia ou o corte Serial exaustivo, que se baseia na amostragem sistêmica do tecido para posterior análise em duas dimensões1, 2. º , 3. no entanto, estes métodos são demorados e necessitam de um elevado nível de formação e especialização4. Os métodos de compensação óptica superam esses problemas equilibrando o índice de refração ao longo de uma amostra para tornar o tecido translúcido para imagens 3-D5,6,7.
Vários métodos de compensação óptica foram desenvolvidos, que se enquadram em duas categorias principais: métodos à base de solvente e aquosa. Métodos de base aquosa podem ser divididos emimersão simples8,9, hiperhidratação10,11e hidrogel incorporando12,13. Os métodos à base de solvente desidratam o tecido, removem os lipídios e normalizam o índice de refração para um valor em torno de 1,55. As limitações da maioria dos métodos baseados em solventes são a têmpera de fluorescência endógena de proteínas de repórter comumente usadas, como GFP, toxicidade por solventes, capacidade de dissolver colas usadas em algumas câmaras de imagem ou lentes objetivas, e encolhimento de tecido durante desidratação14,15,16,17,18,19,20,21. Entretanto, os métodos solvente-baseados são simples, tempo-eficientes, e podem trabalhar em um número de tipos diferentes do tecido.
Os métodos de base aquosa dependem da imersão do tecido em soluções aquosas que possuem índices de refração na faixa de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Estes métodos foram desenvolvidos para preservar a emissão de proteínas de repórter fluorescente endógena e prevenir o encolhimento induzido por desidratação, mas as limitações da maioria dos métodos de compensação à base de aquosa incluem uma duração mais longa do protocolo, expansão tecidual e modificação protéica (ou seja, desnaturação parcial de proteínas por ureia em protocolos hiperhidratantes como SCALea2)7,11,23,25. SCALeS abordou a expansão tecidual através da combinação de ureia com sorbitol, que contrapesos por desidratação a expansão tecidual induzida por ureia, e preservou a ultraestrutura tecidual avaliada pela microscopia eletrônica10. O encolhimento ou a expansão tecidual afetam os tamanhos absolutos das estruturas, as distâncias entre objetos ou a densidade celular por volume; assim, a mensuração das alterações de tamanho na compensação do tecido pode ajudar a interpretar os resultados obtidos7,26.
Em geral, um protocolo para compensação óptica consiste em várias etapas, incluindo pré-tratamento, permeabilização, imunolabeling (se necessário), correspondência de índice de refração e imagem com microscopia de luz avançada (por exemplo, dois fótons, confocal ou microscopia de fluorescência da luz-folha). A maioria das abordagens de compensação foram desenvolvidas para visualizar o tecido neuronal, e estudos emergentes validou sua aplicação em outros órgãos5. Esta ferramenta abrangente tem sido demonstrada anteriormente para permitir a análise confiável e eficiente de estruturas renais, incluindo glomérulos27,28, imune infiltrados28, vasculatura28, e segmentos túbulo 29, e é uma aproximação ideal para melhorar a compreensão da remodelação da função glomerular e do túbulo na saúde e na doença.
Resumido aqui é um método baseado em solvente que combina imunocoloração de túbulos renais; clareira óptica com produtos químicos de etilo (ECi), não tóxico e pronto a utilizar; e a imagem latente da microscopia confocal que permite a visualização e a quantificação completas do túbulo. Este método é simples, combina o antígeno-recuperação de fatias do rim com mancha de anticorpos comerciais, e não exige o equipamento especializado, que o faz acessível à maioria de laboratórios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas de compensação óptica receberam ampla atenção para visualização 3-D e quantificação de microanatomia em vários órgãos. Aqui, o método solvente-baseado do esclarecimento (ECI) foi combinado com o Immunolabeling para a imagem latente 3-D de túbulos inteiros em fatias do rim. Este método é simples, barato e rápido. No entanto, outras questões de pesquisa podem ser melhor respondidas com outros protocolos de compensação5. Também é importante ter em mente que os métodos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O T. S. é apoiado por concessões da Fundação de pesquisa alemão de DFG (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), e a faculdade médica do RWTH AIX-lo-Chapelle (programa do Returner de RWTH). V. G. P. é apoiado por bolsas de pesquisa da Deutsche Gesellschaft Fur Nephrologie, da Fundação Alexander von Humboldt, e do Conselho Nacional de saúde e pesquisa médica da Austrália. D. H. E é apoiado por Fondation LeDucq. R. K. é apoiado por subvenções do DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), o estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e o Centro Interdisciplinar de pesquisa clínica na Universidade RWTH Aachen (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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