Optisk clearing och avbildning av Immunolabeled njure vävnad
Summary
Kombinationen av antikropps märkning, optisk clearing och avancerad ljusmikroskopi möjliggör tredimensionell analys av kompletta strukturer eller organ. Beskrivs här är en enkel metod för att kombinera immunolabeling av tjocka njure skivor, optisk clearing med etylcinnamate, och konfokal avbildning som möjliggör visualisering och kvantifiering av tredimensionella njure strukturer.
Abstract
Optiska clearing tekniker gör vävnaden transparent genom att jämtera brytningsindex i ett prov för efterföljande tredimensionell (3D) avbildning. De har fått stor uppmärksamhet inom alla forskningsområden för potentialen att analysera mikroskopiska flercelliga strukturer som sträcker sig över makroskopiska avstånd. Med tanke på att njurtubuli, vasculature, nerver, och glomeruli sträcker sig i många riktningar, som har endast delvis fångas upp av traditionella tvådimensionella tekniker hittills, vävnad clearing öppnade också många nya områden av njur forskning. Listan över optiska clearing metoder växer snabbt, men det är fortfarande svårt för nybörjare inom detta område att välja den bästa metoden för en given forskningsfråga. Tillhandahålls här är en enkel metod som kombinerar antikropp märkning av tjocka mus njure skivor; optisk clearing med billig, giftfri och klar att använda kemisk etylcinnamat; och konfokal avbildning. Detta protokoll beskriver hur man parfymera njurar och använder ett antigen-hämtningsteg för att öka antikropps bindningen utan att kräva specialiserad utrustning. Dess tillämpning presenteras i Imaging olika flercelliga strukturer inom njuren, och hur man felsöker dålig antikropp penetration i vävnad adresseras. Vi diskuterar också de potentiella svårigheterna med att avbilda endogena fluorofotar och förvärva mycket stora prover och hur man kan övervinna dem. Detta enkla protokoll ger en enkel att installera och omfattande verktyg för att studera vävnad i tre dimensioner.
Introduction
Det växande intresset för att studera hela organ eller stora flercelliga strukturer har lett till utvecklingen av optiska clearing metoder som involverar avbildning av transparent vävnad i tre dimensioner. Fram till nyligen har de bästa metoderna för att uppskatta cellantal, längd eller volym av hela strukturer varit stereo logi eller uttömmande seriell snittning, som bygger på systemisk provtagning av vävnad för efterföljande analys i två dimensioner1, 2 , 3. dessa metoder är dock tidskrävande och behöver en hög utbildningsnivå och expertis4. Optiska clearing metoder övervinna dessa problem genom att för brytningsindex i ett prov för att göra vävnad genomskinlig för 3-D Imaging5,6,7.
Flera optiska clearing metoder har utvecklats som hör till två huvudkategorier: lösningsmedelsbaserade och vattenbaserade metoder. Vattenbaserade metoder kan delas upp ytterligare i enkla Immersion8,9, Hyperhydrering10,11, och hydrogel inbäddning12,13. Lösningsmedelsbaserade metoder torkar vävnaden, avlägsnar lipider och normaliserar brytningsindexet till ett värde runt 1,55. Begränsningar av de flesta lösningsmedelsbaserade metoder är kylning av endogena fluorescens av vanligt förekommande reporter proteiner såsom GFP, lösningsmedelstoxicitet, förmåga att lösa upp lim som används i vissa bild kammare eller objektiva linser, och krympning av vävnad under dehydrering14,15,16,17,18,19,20,21. Lösningsmedelsbaserade metoder är dock enkla, tidseffektiva och kan fungera i ett antal olika vävnadstyper.
Vattenbaserade metoder förlitar sig på nedsänkning av vävnaden i vattenlösningar som har brytningsindex i intervallet 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Dessa metoder har utvecklats för att bevara endogena fluorescerande reporter protein emission och förhindra uttorkning-inducerad krympning, men begränsningar av de flesta vattenbaserade clearing metoder inkluderar en längre varaktighet av protokollet, vävnadsexpansion, och proteinmodifiering (dvs. partiell denaturering av proteiner genom urea i hyperhydrerande protokoll såsom SCALea2)7,11,23,25. SCALeS behandlade vävnadsexpansion genom att kombinera urea med sorbitol, som motbalanserar genom uttorkning urea-inducerad vävnad expansion, och bevarade vävnaden ultrastruktur som utvärderas av elektronmikroskopi10. Vävnad krympning eller expansion påverkar de absoluta storlekarna av strukturer, avstånd mellan objekt, eller celltäthet per volym; Således kan mätningen av storleksändringar vid röjning av vävnaden hjälpa till att tolka de erhållna resultaten7,26.
I allmänhet består ett protokoll för optisk clearing av flera steg, inklusive förbehandling, permeabilisering, immunolabeling (vid behov), refraktiv index matchning och avbildning med avancerad ljusmikroskopi (t. ex. två-Photon, Confocal, eller fluorescens-mikroskopi). De flesta av clearing metoder har utvecklats för att visualisera neuronala vävnad, och nya studier har validerat sin ansökan i andra organ5. Detta omfattande verktyg har tidigare visat sig möjliggöra tillförlitlig och effektiv analys av njur strukturer, inklusive glomeruli27,28, immuninfiltrat28, kärlsystemet28, och tubuli segment 29, och det är en idealisk metod för att bättre förstå glomerulär funktion och tubuli remodeling i hälsa och sjukdom.
Sammanfattas här är en lösningsmedelsbaserade metod som kombinerar immunofärgning av njurtubuli; optisk clearing med billig, giftfri och klar att använda kemisk etylcinnamat (ECi); och konfokal mikroskopi avbildning som möjliggör komplett tubuli visualisering och kvantifiering. Denna metod är enkel, kombinerar antigen-hämtning av njure skivor med färgning av kommersiella antikroppar, och kräver inte specialiserad utrustning, vilket gör den tillgänglig för de flesta laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optisk clearing tekniker har fått stor uppmärksamhet för 3-D visualisering och kvantifiering av mikroanatomi i olika organ. Här, lösningsmedelsbaserade clearing metod (ECi) kombinerades med immunolabeling för 3-D avbildning av hela tubuli i njure skivor. Denna metod är enkel, billig och snabb. Andra forskningsfrågor kan dock bäst besvaras med andra clearingprotokoll5. Det är också viktigt att komma ihåg att lösningsmedelsbaserade metoder orsakar vävnad krympning vid varierande grader…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. stöds av bidrag från den tyska forskningsstiftelsen DFG (332853055), Else kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), och den medicinska fakulteten vid RWTH Aachen (RWTH Returner program). V. G. P. stöds av forskningsstipendier från Deutsche Gesellschaft Fur Nelogie, Alexander von Humboldt Foundation, och nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien. D. H. E stöds av Fondation LeDucq. R. K. stöds av bidrag från DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), staten Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) och tvärvetenskapliga centrum för klinisk forskning vid RWTH Aachen University (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
Riferimenti
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
