Le protocole décrit l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux avec une tache de gel d’ADN disponible dans le commerce, l’acquisition d’une série de time lapse de cellules étiquetées en direct par microscopie d’illumination structurée super-résolution (SR-SIM), et le suivi automatique du mouvement nucléoïde.
Les nucléoïdes mitochondriaux sont des particules compactes formées par des molécules d’ADN mitochondrial enduites de protéines. L’ADN mitochondrial code les ARN, les ARR et plusieurs polypeptides mitochondriaux essentiels. Les nucléoïdes mitochondriaux se divisent et distribuent dans le réseau mitochondrique dynamique qui subit la fission/fusion et d’autres changements morphologiques. La microscopie à fluorescence vivante haute résolution est une technique simple pour caractériser la position et le mouvement d’un nucléoïde. Pour cette technique, les nucléoïdes sont généralement étiquetés par des étiquettes fluorescentes de leurs composants protéiques, à savoir le facteur de transcription a (TFAM). Cependant, cette stratégie a besoin d’une surexpression d’une construction fluorescente marquée par des protéines, qui peut causer des artefacts (rapportés pour TFAM), et n’est pas faisable dans de nombreux cas. Les colorants organiques liant l’ADN n’ont pas ces inconvénients. Cependant, ils montrent toujours la coloration des ADN nucléaires et mitochondriaux, manquant ainsi de spécificité aux nucléoïdes mitochondriaux. En tenant compte des propriétés physico-chimiques de ces colorants, nous avons sélectionné une tache de gel d’acide nucléique (SYBR Gold) et avons obtenu l’étiquetage préférentiel des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes. Les propriétés du colorant, en particulier sa grande luminosité sur la liaison à l’ADN, permettent la quantification ultérieure du mouvement nucléoïde mitochondrial à l’aide d’images d’illumination structurées super-résolution.
Les molécules circulaires d’ADN de 16,5 kbp constituent le matériel génétique des mitochondries, codant 22 tARN, 2 rARN, et 13 polypeptides nécessaires pour les complexes mitochondriaux oxydants de phosphorylation. L’ADN mitochondrial lié au facteur de transcription mitochondrial a (TFAM) et plusieurs autres protéines forment les nucléoïdes mitochondriaux1,2,3,4. Les nucléoïdes mitochondriaux se déplacent et redistribuent entre les composants du réseau mitochondrial5,6 pendant son remodelage morphologique, fission ou fusion selon la phase du cycle cellulaire, le stress, et d’autres facteurs (révisé dans Pernas et al.7). En outre, le mouvement des noyaux mitochondriaux, est impliqué dans la maladie systémique d’érythématosus de lupus8 et peut jouer un rôle dans d’autres maladies. La microscopie de fluorescence est une technique simple pour les études de cellules vivantes des organites, mais la technique a une résolution de ‘gt;200 nm, qui est plus grande que la taille des nucléoïdes mitochondriaux (100 nm9,10,11,12). Cette limite a été contournée par des techniques dites de « super-résolution », telles que l’épuisement des émissions stimulées (STED) et la microscopie de localisation à une seule molécule (SMLM)13,14. Jusqu’à présent, les nucléoïdes mitochondriaux et autres ADN ont été photographiés dans des cellules vivantes par microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)15. Des structures sous-mitochondriales fines avec des positions corrélantes avec l’ADNmn ont été observées par STED dans les cellules vivantes16. Cependant, ces techniques de super-résolution nécessitent une intensité d’éclairage élevée, ce qui provoque des effets phototoxiques sur les cellules vivantes17. Par conséquent, l’imagerie en laps de temps des nucléoïdes mitochondriaux avec la résolution au-delà de la limite de diffraction est difficile. Pour remédier à cette situation, nous avons utilisé une microscopie d’éclairage structurée à super résolution (SR-SIM)18. SIM nécessite une dose de puissance d’éclairage beaucoup plus faible que STED et SMLM19. En outre, contrairement aux techniques STED et SMLM, SIM permet l’imagerie tridimensionnelle (3D) multicolore simple, et il ne nécessite pas de propriétés photophysiques particulières des fluorophores ou de la composition tampon d’imagerie19.
La stratégie conventionnelle pour l’étiquetage des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes est le marquage fluorescent d’une protéine nucléoïde mitochondriale, comme TFAM20. Cependant, dans de nombreux cas, cette stratégie n’est pas appropriée. En outre, la surexpression de TFAM fluorescente étiquetée par protéines produit un artefact sérieux21. L’étiquetage de l’ADN avec des colorants organiques présente des avantages par rapport à une stratégie basée sur les protéines fluorescentes (FP). Les colorants organiques sont exempts de contraintes liées au marquage FP : elles peuvent être utilisées pour n’importe quel type de cellules ou de tissus et peuvent être utilisées à tout moment d’une expérience. L’imagerie cellulaire vivante des nucléoïdes mitochondriaux a été rapportée avec plusieurs colorants de liaison d’ADN : DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, et picoGreen15,25,26. Un inconvénient substantiel de la plupart des colorants de liaison d’ADN pour l’étiquetage nucléoïde est qu’ils tachent tout l’ADN dans la cellule. Cibler un colorant uniquement à l’ADN mitochondrial est hautement souhaitable. Pour ce faire, une sélection minutieuse d’un colorant possédant des propriétés physico-chimiques appropriées est nécessaire. Les colorants lipophiles possédant la charge positive délocalisée, telle que la rhodamine 123, sont connus pour s’accumuler dans les mitochondries vivantes, qui préservent leur potentiel négatif de membrane. En outre, un colorant idéal pour l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux devrait lier l’ADN avec une affinité élevée et émettre une fluorescence lumineuse sur la liaison d’ADN. Compte tenu de ces exigences, certaines cyanines sont prometteuses (par exemple, picoGreen), mais l’ADN nucléaire est abondamment souillé par ces colorants simultanément avec l’ADN mitochondrial15,25,26. Le protocole actuel décrit l’étiquetage spécifique des nucléoïdes mitochondriaux dans les cellules vivantes avec un autre colorant de cyanine, SYBR Gold (SG), et le suivi des nucléoïdes dans les vidéos SIM super-résolution en laps de temps. En outre, les cellules vivantes tachées de SG peuvent être illustrées par n’importe quel type de microscope fluorescent inversé (confocal, disque tournant, épifluorescence, etc.) adapté aux cellules vivantes et équipé d’une source lumineuse de 488 nm.
Il y a plusieurs composantes critiques au protocole : pour obtenir l’étiquetage préférentiel de l’ADN mitochondrial, la concentration du colorant de liaison d’ADN pendant l’incubation devrait être maintenue très basse (p. ex., une dilution de 1:10 000 d’un stock commercial typique), et le temps d’incubation devrait être de 30 min. Le temps d’incubation ne doit jamais dépasser 1 h. Le colorant SYBR Gold doit être utilisé; d’autres colorants liant l’ADN ne sont pas assez brillants pour générer …
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent Asifa Akhtar et Angelika Rambold (à la fois Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) pour la fourniture de cellules HeLa.
Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |