ई. कोलाई में हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति और झिल्ली वेसिकल्स के उत्पादन द्वारा झिल्ली ट्रांसपोर्टरों का लक्षण वर्णन
Summary
हम ई. कोलाई में विषमलोगोस अभिव्यक्ति और फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग करकोशिकाओं के लिसिस द्वारा उत्पादित झिल्ली वेसिकल तैयारी में प्रोटोन-चालित झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
उपन्यास झिल्ली ट्रांसपोर्टरों की कार्यात्मक रूप से विशेषता के लिए कई विधियां विकसित की गई हैं। पॉलीएमाइंस सभी जीवों में सर्वव्यापी हैं, लेकिन पौधों में पॉलीमाइन एक्सचेंजर्स की पहचान नहीं की गई है। यहां, हम एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं के लिसिस से उत्पन्न झिल्ली वेसिकल्स का उपयोग करके पॉलीएमाइन एंटीकुलर की विशेषता के लिए एक विधि रेखांकित करते हैं। सबसे पहले, हमने पॉलीएमाइन और आर्जिनिन एक्सचेंज ट्रांसपोर्टरों में ई. कोलाई तनाव की कमी में AtBAT1 को विषमता पूर्वक व्यक्त किया। वेसिकल्स को एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग करके उत्पादित किया गया था, जो अल्ट्रासेंट्र्युजन द्वारा शुद्ध किया गया था और ट्रांसपोर्टर की सब्सट्रेट विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए लेबल वाले सब्सट्रेट्स की झिल्ली निस्पंदन परख में उपयोग किया जाता था। इन परखों से पता चला कि AtBAT1 आर्जिनिन, एमिनोबुटिरिक एसिड (गाबा), पुत्रस्सिन और शुक्राणुकीं का प्रोटॉन मध्यस्थता करने वाला ट्रांसपोर्टर है । AtBAT1 की परख के लिए विकसित किया गया उत्परिवर्ती तनाव संयंत्र और पशु पॉलीएमाइन एक्सचेंजर्स के अन्य परिवारों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है। हम यह भी परिकल्पना करते हैं कि इस दृष्टिकोण का उपयोग कई अन्य प्रकार के एंटीपोर्टरों की विशेषता के लिए किया जा सकता है, जब तक कि इन प्रोटीनों को बैक्टीरियल सेल झिल्ली में व्यक्त किया जा सकता है। ई. कोलाई उपन्यास ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए एक अच्छी प्रणाली है, क्योंकि देशी ट्रांसपोर्टरों को म्यूटकरने के लिए कई तरीके नियोजित किए जा सकते हैं।
Introduction
मेटाबोलाइट्स की तस्करी में शामिल प्रोटीन शारीरिक विनियमन का एक आवश्यक स्तर का गठन करते हैं, लेकिन पौधों की झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के विशाल बहुमत को अभी तक कार्यात्मक रूप से चित्रित नहीं किया गया है। उपन्यास परिवहन प्रोटीन की विशेषता के लिए कई रणनीतियों को लागू किया गया है। ई. कोलाई और यूकैरियोटिक कोशिकाओं जैसे खमीर, ज़ेनोपस ओसाइट्स, स्तनधारी कोशिकाओं, कीट कोशिकाओं और पौधों की कोशिकाओं जैसे मॉडल जीवों में विषमलॉगस अभिव्यक्ति का उपयोग उनकी परिवहन गतिविधि1निर्धारित करने के लिए किया गया है। यूकेरियोटिक कोशिकाओं को यूकेरियोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इष्ट किया जाता है, क्योंकि बुनियादी सेलुलर संरचना, सिग्नल ट्रांसड्यूइंग रास्ते, प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी मूल परिस्थितियों के अनुकूल हैं।
खमीर पौधों में उपन्यास परिवहन प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव रहा है। पहले पौधे के परिवहन प्रोटीन को खमीरमेंसफलतापूर्वक व्यक्त किया गया था , जो क्लोरेला2से हेक्सोस ट्रांसपोर्टर HUP1 था । तब से, कई संयंत्र परिवहन प्रोटीन कार्यात्मक रूप से खमीर अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके विशेषता है। इनमें प्लांट शुगर ट्रांसपोर्टर्स (एसयूसी1 और एसयूसी23,वीएफएसयूटी1 और वीएफएसटीपी14)और ऑक्सिन ट्रांसपोर्टर्स (AUX1 और पिन5)शामिल हैं । पौधे प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए खमीर का उपयोग करने के नुकसान में प्लास्टिड-स्थानीयकृत प्रोटीन की बिगड़ा गतिविधि शामिल हो सकती है क्योंकि खमीर में इस ऑर्गेनेल की कमी है,6को गलत टार्गेट करना और झिल्ली प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति के कारण खमीर में तनाव प्रतिक्रियाओं का गठन और सक्रियता7,8,9।
ज़ेनोपस ओसाइट्स में परिवहन प्रोटीन की हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति का व्यापक रूप से ट्रांसपोर्टरोंकेइलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए उपयोग किया गया है । ज़ेनोपस ओसाइट्स में हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति का उपयोग करने वाले पहले पौधे परिवहन प्रोटीन अरबीडोपस पोटेशियम चैनल KAT110 और अरबीडोप्सिस हेक्सोज़ ट्रांसपोर्टर एसटीपी 111थे। तब से, ज़ेनोपस ओसाइट्स को प्लाज्मा झिल्लीट्रांसपोर्टर12,वाकुओलर सुक्रोज ट्रांसपोर्टर सुत413 और वाकुओलर मैलेट ट्रांसपोर्टर एएलएमटी914जैसे कई संयंत्र परिवहन प्रोटीन की विशेषता के लिए नियोजित किया गया है। परिवहन परखों के लिए ज़ेनोपस ओसाइट्स की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि इंट्रासेलर मेटाबोलाइट्स की एकाग्रता को हेरफेर नहीं किया जा सकता1. इसके अलावा, Xenopus oocytes तैयार करने के लिए पेशेवर ज्ञान की आवश्यकता होती है और ओसाइट बैचों की परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करना मुश्किल है।
आदर्श जीव ई कोलाई में विषमलॉगस अभिव्यक्ति उपन्यास संयंत्र परिवहन प्रोटीन के लक्षण वर्णन के मामले में एक आदर्श प्रणाली है। एक पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम15के साथ, ई. कोलाई की आणविक और शारीरिक विशेषताओं को अच्छी तरह से जाना जाता है। आणविक उपकरण और तकनीक अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं16. इसके अलावा, विभिन्न अभिव्यक्ति वैक्टर, गैर-रोगजनक उपभेद और म्यूटेंट17,18,19उपलब्ध हैं। इसके अलावा, ई. कोलाई एक उच्च विकास दर है और आसानी से प्रयोगशाला की स्थिति के तहत उगाया जा सकता है । ई. कोलाई9में उच्च मात्रा में कई प्रोटीन को आसानी से व्यक्त और शुद्ध किया जा सकता है। जब प्रोटीन सीधे सेलुलर सिस्टम में नहीं कहा जा सकता है, liposomes में प्रोटीन का पुनर्गठन भी एक सफल रहा है, हालांकि शुद्ध झिल्ली प्रोटीन के लक्षण वर्णन के लिए चुनौतीपूर्ण नवाचार । सोयाबीन, मक्का, चावल और अरबीडोप्सिस में फॉस्फेट ट्रांसपोर्टरों जैसे सोल्यूट ट्रांसपोर्टरों सहित पौधे माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन प्रोटीन का कार्यात्मक लक्षण वर्णन, अरबीडोप्सिस में डाइकार्बोक्लेट-ट्राइकार्बॉक्सिलेट वाहक20,21का उपयोग करके पूरा किया गया है। हालांकि, टमाटर प्रोटीन SICAT9 के पुनर्संयोजन प्रोटीन पुनर्गठन प्रयोगों में nonfunctional पाया गया, और कैट ट्रांसपोर्टर परिवार के अंय सदस्यों को Xenopus oocyte परख22में nonfunctional पाया गया । इस प्रकार, झिल्ली ट्रांसपोर्टरों के लक्षण वर्णन के लिए अतिरिक्त आणविक उपकरणों की आवश्यकता होती है।
ई. कोलाई23में पांच पॉलीएमाइन परिवहन प्रणालियां पाई जाती हैं । इनमें दो एबीसी ट्रांसपोर्टर शुक्राणुऔर पुत्रस्सिन के तेज, एक पुटरेसिन/ऑर्निथिन एक्सचेंजर, एक शवासीन/लाइसिन एक्सचेंजर, एक शुक्राणुनिर्यातक और एक पुत्रस्सिन आयातक शामिल हैं । putrescine एक्सचेंजर PotE मूल रूप से एक वेसिकल परख का उपयोग कर विशेषता थी, जहां अंदर बाहर vesicles एक फ्रांसीसी प्रेस के साथ lysing कोशिकाओं द्वारा तैयार किया गया था और ऑरलैंडाइल24के बदले में वेसिकल्स में रेडियोलेबल putrescine के तेज मापने । वेसिकल परखों का उपयोग कैल्शियम ट्रांसपोर्टर की विशेषता के लिए भी किया जाता था, जिसने प्रोटोन ढाल25के जवाब में कैल्शियम के परिवहन में मध्यस्थता की। इन प्रयोगों ने हमें अन्य पॉलीएमाइन एक्सचेंजर्स के लक्षण वर्णन के लिए एक रणनीति विकसित करने के लिए प्रेरित किया। हमने सबसे पहले पोटे और कैडबी एक्सचेंजर्स में ई कोलाई की कमी का तनाव पैदा किया । यहां, हम संशोधित ई. कोलाई तनाव में विषमता अभिव्यक्ति द्वारा एक पौधे पॉलीमाइन एंटीपोर्टर के कार्यात्मक लक्षण वर्णन, एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग कर झिल्ली वेसिकल्स की पीढ़ी, और रेडियोलेबल assays प्रदर्शित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन में, हम पहले ई कोलाई में प्रोटीन व्यक्त करके और फिर झिल्ली वेसिकल पैदा करके एंटीपोर्टर के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं, ताकि विषमता-व्यक्त प्रोटीन को सेल-मुक्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के लिए समर्थन BGSU ग्रेजुएट कॉलेज, और प्रायोजित कार्यक्रमों और अनुसंधान के BGSU कार्यालय से आया था ।
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
| 3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
| 4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
| 14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
| Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
| Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
| Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
| Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
| Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
| French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
| Glycerol | |||
| GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
| Hydrogen peroxide | KROGER | ||
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
| Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ||
| Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
| PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
| Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
| putrescine | fluka | 32810 | |
| Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
| Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
| Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
| Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
| Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
| Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
| Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |
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