大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生
Summary
フランスのプレスを用いた大腸菌の異種発現と細胞の分解によって産生される膜小胞製剤におけるプロトン駆動膜トランスポーターの特性評価方法について説明する。
Abstract
新規膜トランスポーターを機能的に特徴付けるいくつかの方法が開発されている。ポリアミンはすべての生物において普遍的であるが、植物中のポリアミン交換器は同定されていない。ここでは、異種植物抗ポーターを発現する大腸菌細胞の分解から発生する膜小胞を用いてポリアミン抗ポーターを特徴付ける方法を概説する。まず、ポリアミンおよびアルギニン交換トランスポーターにおいて欠損した大腸菌株中のAtBAT1を異種発現した。小胞は、フランスのプレスを使用して製造され、超遠心分離によって精製され、トランスポーターの基質特異性を実証するために標識基板の膜濾過アッセイに利用された。これらのアッセイは、AtBAT1がアルギニン、γ-アミノ酪酸(GABA)、プトレシンおよびスペルミジンのプロトン媒介トランスポーターであることを実証した。AtBAT1のアッセイのために開発された変異株は、植物および動物ポリアミン交換器の他のファミリーの機能解析に有用であり得る。我々はまた、これらのタンパク質が細菌細胞膜で発現できる限り、このアプローチは他の多くのタイプの抗ポーターを特徴付けるために使用できると仮定する。大腸菌は、ネイティブトランスポーターを変異化するために使用することができる複数の方法があるので、新規トランスポーターの特性評価のための良いシステムです。
Introduction
代謝産物の密売に関与するタンパク質は、生理学的調節の本質的なレベルを構成するが、植物膜トランスポーターの大半はまだ機能的に特徴付けされていない。新規輸送タンパク質を特徴付けるために、いくつかの戦略が実施されている。酵母、ゼノプス卵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞などの大腸菌および真核細胞などのモデル生物における異種発現は、いずれもその輸送活性を決定するために使用されている1。真核細胞は真核生物タンパク質の発現に好まれ、基本的な細胞組成、シグナル伝達経路、転写および翻訳機械は、天然の条件と互換性があるからである。
酵母は、植物における新規輸送タンパク質の特性評価のための重要なモデル生物となっています。酵母(サッカロミセスポンベ)で正常に発現した最初の植物輸送タンパク質は、クロレラ2からヘキ酸トランスポーターHUP1であった。それ以来、多くの植物輸送タンパク質は、酵母発現系を用いて機能的に特徴付けられてきた。これらには、植物糖トランスポーター(SUC1およびSUC23、VfSUT1およびVfSTP14)およびオーキシントランスポーター(AUX1およびPIN5)が含まれる。植物タンパク質を発現するために酵母を利用する欠点は、酵母がこのオルガネラを欠いているため、プラスチド局在タンパク質の活性障害、6を誤って標的化し、膜タンパク質の過剰発現による酵母における誤折凝集体およびストレス応答の活性化を含むことができる。
ゼノプス卵母細胞における輸送タンパク質の異種発現は、トランスポーター10の電気生理学的特性評価のために広く使用されている。ゼノプス卵母細胞における異種発現を用いて特徴づけられた最初の植物輸送タンパク質は、アラビドプシスカリウムチャネルKAT111およびアラビドプシスヘキソプシストランスポーターSTP111であった。それ以来、ゼノプス卵母細胞は、血漿膜トランスポーター12、空胞スクローストランスポーターSUT413および空胞軟質泌トランスポーターALMT914などの多くの植物輸送タンパク質を特徴付けるために採用されている。輸送アッセイのためのゼノプス卵母細胞の重要な制限は、細胞内代謝産物の濃度が操作できないということです 1.さらに、ゼノプス卵母細胞を調製するために専門的な知識が必要であり、卵母細胞バッチの変動性を制御することは困難である。
モデル生物大腸菌における異種発現は、新規植物輸送タンパク質の特性評価の点で理想的なシステムである。完全に配列されたゲノム15では、大腸菌の分子的および生理学的特徴がよく知られている。分子ツールと技術は十分に確立されています16.加えて、異なる発現ベクター、非病原性株および変異体は、17、18、19で利用可能である。さらに、大腸菌は高い成長率を有し、実験室条件下で容易に成長することができる。多くのタンパク質は、大腸菌9において高量で容易に発現および精製することができる。タンパク質を細胞系で直接アッセイできない場合、タンパク質をリポソームに再構成することも成功していますが、精製膜タンパク質の特性評価に関する革新は困難です。植物ミトコンドリア輸送タンパク質の機能特性評価は、大豆中のリン酸トランスポーターなどの溶質トランスポーターを含む、トウモロコシ、米およびアラビドプシス、ジカルボン酸トリカルボン酸キャリアをアラビドプシス中で、このモデルシステム20、21を用いて達成されている。しかしながら、トマトタンパク質SICAT9の組換えタンパク質は再構成実験において機能的でないことが判明し、CATトランスポーターファミリーの他のメンバーはゼノプス卵母細胞アッセイ22において機能的でないことが判明した。したがって、膜トランスポーターの特性評価には追加の分子ツールが必要です。
5つのポリアミン輸送システムが大腸菌23に見られる。彼らは、スペルミジンとプトレシンの取り込みを仲介する2つのABCトランスポーター、プトレシン/オルニチン交換器、カダベリン/リジン交換器、スペルピジン輸出業者とプトレシン輸入業者が含まれます。プトレシン交換器PotEはもともと小胞アッセイを使用して特徴付けられていたが、そこではフランスのプレスで細胞をライジングし、オルニチン24と引き換えに放射性標識プトレシンの取り込みを測定することによって小胞を調製した。小胞アッセイはまた、プロトン勾配25に応答してカルシウムの輸送を媒介するカルシウムトランスポーターを特徴付けるために使用された。これらの実験は、他のポリアミン交換器の特性評価のための戦略を開発することを促しました。私たちはまず、PotEとCadB交換器で大腸菌欠乏株を作成しました。ここでは、修飾大腸菌株における異種発現による植物ポリアミン抗ポーターの機能的特徴、フランス語プレスを用いた膜小胞の生成、放射線標識アッセイを示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、まず大腸菌でタンパク質を発現し、次に膜小胞を生成し、異種発現タンパク質を無細胞系でアッセイできるようにすることにより、抗ポーターの特性評価方法を概説する。ほとんどの分子生物学ラボで見られる機器に加えて、この戦略は、フランスのプレス、超遠心分離機、および放射性同位元素アッセイを行うための施設へのアクセスを使用する必要があります。
<p…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトへの支援は、BGSU大学院、およびスポンサープログラムと研究のBGSUオフィスから来ました。
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
| 3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
| 4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
| 14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
| Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
| Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
| Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
| Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
| Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
| French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
| Glycerol | |||
| GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
| Hydrogen peroxide | KROGER | ||
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
| Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ||
| Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
| PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
| Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
| putrescine | fluka | 32810 | |
| Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
| Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
| Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
| Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
| Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
| Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
| Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |
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