Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln
Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung von protonengetriebenen Membrantransportern in Membranvesikelpräparaten, die durch heterologe Expression in E. coli und Lyse von Zellen mit einer französischen Presse hergestellt werden.
Abstract
Mehrere Methoden wurden entwickelt, um neuartige Membrantransporter funktionell zu charakterisieren. Polyamine sind in allen Organismen allgegenwärtig, aber Polyaminaustauscher in Pflanzen wurden nicht identifiziert. Hier skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung von Polyamin-Antiportern mit Membranvesiken, die aus der Lyse von Escherichia coli-Zellen erzeugt werden, die heterolog einen Pflanzenantiporter exemitzen. Zunächst haben wir AtBAT1 heterolog in einem E. coli-Stamm mangelhaft in Polyamin- und Argininaustauschtransportern exprimiert. Vesikel wurden mit einer französischen Presse hergestellt, die durch Ultrazentrifugation gereinigt und in einem Membranfiltrationstest von markierten Substraten verwendet wird, um die Substratspezifität des Transporters zu demonstrieren. Diese Assays zeigten, dass AtBAT1 ein Proton-vermittelter Transporter von Arginin, Aminobuttersäure (GABA), Putrescin und Spermidin ist. Der mutierte Stamm, der für den Test von AtBAT1 entwickelt wurde, kann für die funktionelle Analyse anderer Familien von Pflanzen- und Tierpolyaminaustauschern nützlich sein. Wir gehen auch davon aus, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um viele andere Arten von Antiportern zu charakterisieren, solange diese Proteine in der bakteriellen Zellmembran exprimiert werden können. E. coli ist ein gutes System für die Charakterisierung neuartiger Transporter, da es mehrere Methoden gibt, die eingesetzt werden können, um einheimische Transporter zu mutagenisieren.
Introduction
Proteine, die am Handel mit Metaboliten beteiligt sind, stellen ein wesentliches Maß an physiologischer Regulation dar, aber die überwiegende Mehrheit der Pflanzenmembrantransporter ist noch nicht funktionell charakterisiert. Mehrere Strategien wurden implementiert, um neuartige Transportproteine zu charakterisieren. Heterologe Expression in Modellorganismen wie E. coli und eukaryotischen Zellen wie Hefe, Xenopus Oozyten, Säugetierzellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen wurden alle verwendet, um ihre Transportaktivität zu bestimmen1. Eukaryotische Zellen werden für die Expression von eukaryotischen Proteinen bevorzugt, da die grundlegende zelluläre Zusammensetzung, Signaltransducing-Pfade, Transkription und Übersetzungsmaschinen mit den nativen Bedingungen kompatibel sind.
Hefe war ein wichtiger Modellorganismus für die Charakterisierung neuartiger Transportproteine in Pflanzen. Das erste Pflanzentransportprotein, das erfolgreich in Hefe exprimiert wurde (Saccharomyces pombe) war der Hexose-Transporter HUP1 von Chlorella2. Seitdem wurden viele Pflanzentransportproteine funktionell mit einem Hefeexpressionssystem charakterisiert. Dazu gehören Pflanzenzuckertransporter (SUC1 und SUC23, VfSUT1 und VfSTP14) und die Auxin-Transporter (AUX1 und PIN5). Nachteile der Verwendung von Hefe, um pflanzliche Proteine auszudrücken, können eine beeinträchtigte Aktivität von plastid-lokalisierten Proteinen umfassen, da Hefe diese Organelle fehlt, Fehlausrichtung6, und Bildung von falsch gefalteten Aggregaten und Aktivierung von Stressreaktionen in Hefe aufgrund der Überexpression von Membranproteinen7,8,9.
Heterologe Expression von Transportproteinen in Xenopus Oozyten wurde häufig für die elektrophysiologische Charakterisierung von Transportern10verwendet. Die ersten pflanzentransportinochig charakterisierten Pflanzentransportproteine, die mit heterologer Expression in Xenopus oocyten charakterisiert wurden, waren der Arabidopsis Kaliumkanal KAT110 und der Arabidopsis Hexose Transporter STP111. Seitdem wurden Xenopus Oozyten eingesetzt, um viele Pflanzentransportproteine wie Plasmamembrantransporter12, Vacuolar-Saccharosetransporter SUT413 und Vacuolar-Malattransporter ALMT914zu charakterisieren. Eine wichtige Einschränkung von Xenopus Oozyten für Transporttests ist, dass die Konzentration von intrazellulären Metaboliten nicht manipuliert werden kann1. Darüber hinaus sind professionelle Kenntnisse erforderlich, um Xenopus Oozyten vorzubereiten, und die Variabilität der Eizellenchargen ist schwer zu kontrollieren.
Heterologe Expression im Modellorganismus E. coli ist ein ideales System in Bezug auf die Charakterisierung neuartiger Pflanzentransportproteine. Mit einem vollständig sequenzierten Genom15sind die molekularen und physiologischen Eigenschaften von E. coli bekannt. Molekulare Werkzeuge und Techniken sind gut etabliert16. Darüber hinaus stehen verschiedene Expressionsvektoren, nichtpathogene Stämme und Mutanten zur Verfügung17,18,19. Darüber hinaus hat E. coli eine hohe Wachstumsrate und kann leicht unter Laborbedingungen angebaut werden. Viele Proteine können leicht in hohen Mengen in E. coli9exprimiert und gereinigt werden. Wenn Proteine nicht direkt in zellulären Systemen untersucht werden können, war die Rekonstitution von Proteinen zu Liposomen auch eine erfolgreiche, wenn auch herausfordernde Innovation für die Charakterisierung gereinigter Membranproteine. Die funktionelle Charakterisierung der mitochondrialen Transportproteine der Pflanze einschließlich gelöster Transporter wie Phosphattransporter in Sojabohnen, Mais, Reis und Arabidopsis, Dicarboxylat-Tricarboxylatträger in Arabidopsis wurde mit diesem Modellsystem20,21erreicht. Jedoch, rekombinante Proteine des Tomatenproteins SICAT9 wurden festgestellt, dass nicht funktional in Rekonstitutionsexperimente, und andere Mitglieder der CAT-Transporter-Familie wurden gefunden, um nicht funktional in Xenopus Oozyten-Assays22. Daher werden zusätzliche molekulare Werkzeuge für die Charakterisierung von Membrantransportern benötigt.
Fünf Polyamin-Transportsysteme sind in E. coli23zu finden. Dazu gehören zwei ABC-Transporter, die die Aufnahme von Spermidin und Putrescin vermitteln, einen Putrescine/Ornithin-Austauscher, einen Kadaverin/Lysinaustauscher, einen Spermidinexporteur und einen Putrescine-Importeur. Der Putrescine-Austauscher PotE wurde ursprünglich mit einem Vesikel-Assay charakterisiert, bei dem von innen nach außen Vesikel durch Lysingzellen mit einer französischen Presse hergestellt und die Aufnahme von radioaktiv markiertem Putrescin in die Vesikel im Austausch gegen Ornithin24gemessen wurden. Vesikel-Assays wurden auch verwendet, um einen Kalziumtransporter zu charakterisieren, der den Transport von Kalzium als Reaktion auf einen Protonengradientenvermittelte 25. Diese Experimente veranlassten uns, eine Strategie für die Charakterisierung anderer Polyaminaustauscher zu entwickeln. Wir haben zuerst einen Stamm von E. coli-Mangel an PotE- und CadB-Austauschern entwickelt. Hier zeigen wir die funktionelle Charakterisierung eines Pflanzenpolyamin-Antiporters durch heterlogen Ausdruck im modifizierten E. coli-Stamm, die Erzeugung von Membranbläschen mit einer französischen Presse und radioaktiv markierte Assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der vorliegenden Studie skizzieren wir eine Methode zur Charakterisierung eines Antiporters, indem wir zuerst das Protein in E. coli exprimieren und dann Membranbläschen erzeugen, so dass das heterologös exprimierte Protein in einem zellfreien System untersucht werden kann. Zusätzlich zu den Geräten, die in den meisten molekularbiologischen Labors zu finden sind, erfordert diese Strategie den Einsatz einer französischen Presse, einer Ultrazentrifuge und zugang zu einer Einrichtung zur Durchführung von R…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützung für dieses Projekt kam vom BGSU Graduate College und dem BGSU Office of Sponsored Programs and Research.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3H-putrescine | PerkinElmer | NET185001MC | |
| 3H-spermidine | PerkinElmer | NET522001MC | |
| 4-chloro-1-naphthol | Sigma-Aldrich | C8890 | |
| 14C arginine | Moravek Inc. | MC137 | |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A-5006 | |
| Anti-His (C-term)-HRP antibody | ThermoFisher | R931-25 | Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher | 23227 | Pierce BCA protein asay kit. |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 161-0404 | |
| Carboxypeptidase B | Sigma-Aldrich | C9584-1mg | |
| Centrifuge | Sorvall | SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor | |
| Dounce tissue grinder | LabGenome | 7777-7 | Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout. |
| Ecoscint-H | National Diagnostics | LS275 | scintillation cocktail |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Filtration manifold | Hoefer | FH225V | |
| French Pressure Cell | Glen Mills | FA-080A120 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G6904 | |
| Glycerol | |||
| GraphPad Prism software | http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm | ||
| Hydrogen peroxide | KROGER | ||
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Liquid scintillation counter | Beckman | LS-6500 | |
| Maleate | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ||
| Nitrocellulose membrane filters | Merck Millipore | hawp02500 | 0.45 µM |
| PCR clean up kit | Genscript | QuickClean II | |
| Potassium Phosphate dibasic | ThermoFisher | P290-500 | |
| putrescine | fluka | 32810 | |
| Potassium Phosphate monobasic | J.T.Baker | 4008 | |
| Spermidine | Sigma-aldrich | S2501 | |
| Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 | This manuscript | Available upon request. | Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers. |
| Tris-base | Research Products | T60040-1000 | |
| Ultracentrifuge | Sorvall MTX 150 | 46960 | Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor |
| Ultracentrifuge tubes | ThermoFisher | 45237 | Centrifuge tubes for S150-AT rotor |
| Vector: pBAD-DEST49 | ThermoFisher | Gateway expression vector for E. coli |
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